用于氧化还原反应的试剂组合物的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于改善用于氧化还原反应的试剂的稳定性的稳定性组合物，并且涉及具有改善的稳定性的用于氧化还原反应的试剂组合物。用于氧化还原反应的试剂组合物可以被应用于电化学生物传感器的试剂。
【背景技术】
[0002]血糖水平的周期性测量对于管理糖尿病是重要的，并且已经通过使用各种具有精确度和准确度的电化学生物传感器进行。用于测量血糖水平的电化学传感器通过以下方法制造:将包括酶、电子转移剂(electron transfer)和各种稳定剂以及分散剂的试剂施加到工作电极，并干燥施加有试剂的工作电极。影响电化学生物传感器的特性的最重要的因素是酶和电子转移剂的性能。
[0003]例如，最商业可得的电化学传感器使用的作为葡萄糖氧化还原酶的FAD-GOx (黄素腺嘌呤二核苷酸-葡糖氧化酶)具有热稳定性和对仅氧化葡萄糖的反应特异性，但是，通过使用采用FAD-GOx的传感器，趋于对血源如静脉血、动脉血和外周血显示大的测量值的波动，这是因为酶与溶解在血液中的氧发生反应。
[0004]同时，采用吡咯喹诺酮醌-葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)的传感器几乎不受血氧的影响，但显示对单糖类如甘露糖、麦芽糖和乳糖或二糖类的特异性。尤其是，已经报道了由于具有肾腹膜透析的患者体中麦芽糖的影响，传感器可以引起团体医学实践(facultymedical practice) ο采用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸_葡萄糖脱氢酶(NAD-GDH)的传感器比PQQ-GDH显示更好的反应特异性，这是因为它不与二糖类如甘露糖、麦芽糖和乳糖发生反应，但具有需要NAD+或NADP +作为辅助因子以及低储存稳定性的缺点。
[0005]最近，使用黄素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)的电化学传感器已经被广泛使用，这是因为它不受血氧的量的影响，具有高的稳定性并且不像PQQ-GDH具有对麦芽糖的特异性。然而，根据产生酶的细菌或真菌的种类，FAD-GDH可使用有限种类的电子转移剂(介体)。
[0006]铁氰化钾[K3Fe(CN)6]通常被用作电子转移剂。其廉价并且由于高反应性可用于采用FAD-GOx、PQQ-GDH、或FAD-GDH的传感器。然而，使用铁氰化钾作为电子转移剂的传感器可显示由血液中的干扰物质如尿酸或龙胆酸引起的测量误差，并且由于温度和湿度引起的劣化而必须被特别小心地制造和储存。此外，因为被储存长时间之后的接地电流(groundcurrent)的变化，难以精确地检测低浓度的葡萄糖。
[0007]与铁氰化物相比，三氯化六铵合钌[Ru (NH3) 6C13]具有更好的氧化还原稳定性。利用三氯化六铵合钌作为电子转移剂的传感器可以容易地制造和储存，并且在长时间的储存之后接地电流的变化小。然而，三氯化六铵合钌不能与FAD-GDH —起使用，这导致难以制造商业可用的传感器。
[0008]最近，存在几种尝试以通过使用特殊类型的生物传感器来检测血糖，该生物传感器使用具有纳米孔表面、而不包括酶和电子转移剂的电极。例如，US8，083，926提出了通过使用具有环糊精纳米孔的电极检测低浓度的葡萄糖的方法。这种传感器不适于检测非常小量的葡萄糖，并且不适于传感器的大量生产。
[0009]因此，仍然需要用于氧化还原反应的试剂，或更具体地，用于电化学生物传感器的用于氧化还原反应的试剂，其不受氧的影响，由温度、湿度和长期储存引起的性能变化范围小，检测宽范围的葡萄糖浓度，并且适于大量生产。本发明提供了满足要求的生物传感器试剂组合物。
【发明内容】
[0010]本发明人确认了通过添加亲水性包合化合物(inclus1n compound)至可用于电化学生物传感器的用于氧化还原反应的试剂，可以稳定氧化还原酶和电子转移剂，并且完成了本发明。
[0011]因此，本发明的实施方式提供了组合物，其包括含亲水性包合化合物，该组合物用于稳定用于氧化还原反应的试剂。
[0012]另一实施方式提供了具有改善的稳定性的用于氧化还原反应的试剂组合物，其包括氧化还原酶、电子转移介体和亲水性包合化合物。
[0013]进一步的实施方式提供了制备具有改善的稳定性的用于氧化还原反应的试剂组合物的方法，其包括混合氧化还原酶、电子转移介体和亲水性包合化合物的步骤。
[0014]进一步的实施方式提供了电化学生物传感器，其包括可用于电化学生物传感器的具有改善的稳定性的用于氧化还原反应的试剂组合物。
【附图说明】
[0015]图1是根据本发明的实施方式的平面式生物传感器的分解斜视图。
[0016]图2是根据本发明的实施方式的面对面式(夹层式)生物传感器的分解斜视图。
[0017]图3是显示使用本发明的实施例2中的平面式生物传感器由各种葡萄糖浓度引起的电流变化的图。
[0018]图4是显示使用本发明的实施例1中的面对面式生物传感器由各种葡萄糖浓度引起的电流变化的图。
[0019]图5是显示当在50°C下温育实施例3和对比例2的面对面式生物传感器并根据本发明实施例3施加各种葡萄糖浓度时斜率变化的图。
[0020]图6是本发明的实施方式使用的硫堇的结构。
[0021]图7是本发明的实施方式使用的硫堇衍生物的结构。
【具体实施方式】
[0022]本发明人发现了，当硫堇或1-甲氧基PMS(1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐)和三氯化六铵合钌组合作为用于FAD-GDH酶的电子转移介体使用时，酶和电子转移介体之间的增加的反应速率显著改善了对葡萄糖的检测性能，并且提交了用于生物传感器的试剂组合物的专利申请(韩国专利申请号2012-0009668)。
[0023]如之前申请中所述，硫堇(图6)和具有相似结构的硫堇衍生物(图7)被一起用作第二电子转移介体以便增加含金属的络合物如三氯化六铵合钌(作为第一电子转移介体)和具有低反应性的氧化还原酶的反应速率，因此引起了不稳定的问题。本发明人持续研宄以解决不稳定的问题，并发现当亲水性包合化合物(inclus1n compound)如轻丙基一 α _环糊精(HP- α -⑶)、轻丙基-β-环糊精(HP- β -⑶)或轻丙基_y_环糊精(HP- γ -CD)被添加至试剂组合物作为试剂稳定剂传感器时，氧氧化还原反应效率和葡萄糖检测的性能改变几乎检测不到。亲水性包合化合物可与硫堇形成包合络合物，从而增加硫堇的溶解度，并且可限制与酶的直接反应，从而增加试剂组合物的稳定性。例如，HP-β-CD具有非常高的水溶性，使得其可以被溶解在水中至50% (w/v)每单位体积。ΗΡ-β-CD可与难溶性材料形成络合物，得到溶解在水中的稳定络合物。
[0024]本发明人发现了，在电化学生物传感器(包括FAD-GDH、转移介体的三氯化六氨合钌和硫堇)中含有亲水性包合化合物，可被用作用于氧化还原反应的试剂，其满足不与氧反应的性能，由温度和湿度引起的性能改变非常小，不影响由干扰物质引起的检测灵敏度，以及良好的长期稳定性，并且亲水性包合化合物可被用作用于电化学生物传感器的试剂和使用其的生物传感器，从而完成了本发明。
[0025]根据本发明，用于氧化还原反应的试剂或更具体地可用于电化学生物传感器的用于氧化还原反应的试剂不受氧的影响，由温度、湿度和长期储存引起的性能变化范围小，检测宽范围的葡萄糖浓度(例如，5至1000mg/dL)，并且适于大量生产。
[0026]在另一实施方式中，试剂组合物被应用于葡萄糖-检测生物传感器作为实例，但可以应用于各种生物传感器，通过改变使用的酶检测不同种类的物质如胆固醇、乳酸盐、肌酸、氢过氧化物、乙醇、氨基酸和谷氨酸盐。
[0027]根据本发明，用于生物传感器的试剂的稳定剂和包括该稳定剂的试剂组合物不受氧和干扰物质的影响，由温度、湿度和长期储存引起的性能变化范围小，因此可用作电化学生物传感器，检测血液中的各种代谢物，特别是葡萄糖。
[0028]如上所述，本发明的实施方式提供用于稳定用于氧化还原反应的试剂的组合物，该组合物包括亲水性包合化合物。
[0029]本发明的实施方式提供用于生物传感器的试剂，包括亲水性包合化合物，因为用于氧化还原反应的试剂可用于电化学生物传感器的试剂。
[0030]本发明的实施方式提供具有增加的稳定性的用于氧化还原反应的试剂组合物，包括氧化还原酶、电子转移介体和亲水性包合化合物。
[0031]本发明的实施方式提供用于生物传感器的试剂，包括氧化还原酶、电子转移介体和亲水性包合化合物，因为用于氧化还原反应的试剂可用于电化学生物传感器的试剂。
[0032]本发明的实施方式提供制备用于氧化还原反应的试剂的方法，包括混合氧化还原酶、电子转移介体和亲水性包合化合物的步骤。
[0033]本发明的实施方式提供制备可用于电化学生物传感器的用于氧化还原反应的试剂的方法，包括混合氧化还原酶、电子转移介体和亲水性包合化合物的步骤，因为用于氧化还原反应的试剂可用于电化学生物传感器的试剂。
[0034]本发明的实施方式提供电化学生物传感器，包括具有增加的稳定性的用于电化学生物传感器的试剂组合物。
[0035]下文中将更详细地解释本发明。
[0036]在本文中，“包合化合物”是指笼形化合物(clathrate compound)或围栏化合物(enclosure compound)，并且意指这样的络合物:其中一个化合物形成格栅腔体，另一个化合物在合适条件下配合在该格栅腔体中。
[0037]亲水性包合化合物可为选自由环糊精及其衍生物组成的组的至少一种化合物，更优选环糊精。环糊精可减少葡萄糖检测能