一株高产油栅藻及其筛选、培养方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及一株高产油栅藻及其筛选、培养方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 随着经济与社会的快速发展，人类对于煤炭、石油、天然气等化石燃料的消耗与需 求量越来越大，然而此类化石燃料都是不可再生的。根据2009年世界各国石油探明储量的 调查结果显示：世界石油总量共计1342. 2X109桶，可供使用40年，然而中国的石油总量仅 有16X109桶，世界排名13位，因此寻找可再生的替代新能源迫在眉睫。近年来微藻产油 成为各国的研宄热点，微藻作为生产生物柴油的原材料具有环境适应性强、细胞繁殖快、生 长周期短、光合作用效率高、固碳能力强、不占用农业耕地等优点。然而，由于部分微藻的油 脂含量不高，微藻培养的成本高这两大问题制约了微藻产油大规模的商业化生产。因此，筛 选富油微藻，提高油脂产量，降低微藻的培养成本，提高微藻的生物质产率及油脂产率成为 研宄的热点和焦点。
[0003] 早在1978年美国可再生能源实验室发起的水生物种项目中已从美国大陆及夏威 夷岛的各水体中分离得到3000多株微藻，进而从中筛选出具有高产油脂特性的微藻。近些 年来国内也有学者从当地水域中分离筛选富油微藻。微藻种类繁多，分布广泛，生存能力 强，为筛选藻株提供了良好的基础。
[0004] 研宄表明生活污水中含有藻类生长所需要的氮磷等营养物质，因此，研宄者 提出用生活污水替代微藻培养基培养微藻产油这一概念。中国台湾的Yang等人筛选 了当地的海洋微藻处理生活污水，最终获得的油脂含有较高浓度的二十二碳六烯酸 (DocosahexaenoicAcid，DHA)是有六个双键的多元不饱和脂肪酸（C22H3202)，其是一种D-3 必需脂肪酸，俗称"脑黄金"，是神经系统细胞生长及维持的重要元素。清华大学胡洪营等人 也利用二级生活污水培养筛得的栅藻（Scenedesmusbijugasp.LX1)，研宄表明该栅藻有 较好的油脂积累特性以及氮磷去除能力。然而并非所有微藻都能在生活污水中生长，从当 地水体中筛得的微藻具有更好的环境适应性和高产油脂性能。筛得的微藻能够吸收生活污 水中的氮磷等营养物质同时合成自身物质促进油脂积累，不仅降低了污水中污染物的含量 使得污水能够达标排放，大大降低了微藻培养的成本；并且提高油脂产量。因此生活污水培 养微藻产油这一概念既具有环境效益又具有经济效益。
【发明内容】
[0005] 本发明以提高微藻油脂产量，降低微藻培养成本为立足点提供一种高产油栅藻的 筛选及其培养方法和应用，通过平板法与96孔板法从济南市当地池塘、湖泊筛选环境适应 性强的富油微藻，利用生活污水来培养藻类以此获得高的生物量及油脂产量，实现废物培 养能源微藻和能源微藻处理废水的有机统一。
[0006] 为解决上述问题，本发明是通过以下方案实现的：
[0007] 一株高产油栅藻SDEC-12,其特征在于，为ScenedesmusbijugaSDEC-12,其保藏 编号为CCTCCNO:M2014497,保藏日期为2014年10月19日，保藏单位为中国典型培养物 保藏中心。该株栅藻SDEC-12能够在人工配置的生活污水中快速生长并且高效积累油脂。
[0008] 上述的高产油栅藻SDEC-12,其核苷酸序列包括SEQIDNo.KJ413176所示的核苷 酸序列。
[0009] 上述的高产油栅藻SDEC-12培养基，为生活污水，初始水质参数（mg/L)为：C0Dra: 340-400,NH4+-N: 10-15,TN: 70-80,TP:5-7,pH值在 8. 1-8. 7 之间，接种后的藻细胞密度为 0? 35 ?0?lg/L。
[0010] 上述的高产油栅藻SDEC-12培养基的应用，所述的培养基培养高产油栅藻SDEC-12,得到高产油栅藻SDEC-12藻粉。所述高产油栅藻SDEC-12藻粉的油脂含量27. 5%， 油脂产率为7. 88mg/L/d。
[0011] 本发明还提供了一种培养上述高产油栅藻SDEC-12的培养方法，包括如下步骤：
[0012] 1)栅藻SDEC-12于BG-11培养基中富集培养，BG-11成份和用量为 NaN031500mg.L'lyiPOJ〗.5 ?84. 3mg?L'MgSOi.7H20 75mg.L'CaCl2 .2H20 36mg.I71， 梓樣酸 6mg?LS梓樣酸铁按 6mg?LSEDTANa2lmg?LSNa2C0320mg?LSH3B032. 86mg?LS MnCl2 ? 4H20 1. 86mg?I71，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg?I71，Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg?I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg?I71，Co(N03) 2 ? 6H20 0? 05mg?I71，初始pH值在 6. 9-7. 5 之间；
[0013] 2)将富集培养后的栅藻SDEC-12接种于人工配制的污水中，放置于光照培养箱 中培养，培养条件为光照度：40001ux，温度：25土1°C，全光照；所述人工配制的污水中各成 分与用量为可溶性淀粉：〇?lg/L，尿素：0? 075g/L，（NH4)2S04:0. 15g/L，K2HP04 2H20 :0? 04g/ L，MgS04 7H20:0. 075g/L，NaHC03:0. 30g/L以及6mL微量元素液；所述微量元素液包括 0.75g/LNa2EDTA，97.0mg/LFeCl3.6H20,41.0mg/LMnCl2.4H20,5.0mg/LZnCl2.6H20,2.0mg/L C〇C12.6H20,4.Omg/LNa2Mo04 2H20 ;
[0014] 3)待到栅藻SDEC-12生长至稳定期后离心收获，收获后的藻泥进行冷冻干燥，即 得到的干藻粉。
[0015] 上述的高产油栅藻SDEC-12在处理污水和/或废气中的用途。
[0016] 进一步的，所述处理为净化。
[0017] 更进一步，所述污水为工业废水或城市生活污水，所述废气为工业废气。
[0018] 上述的高产油栅藻SDEC-12在制备生物柴油和/或油脂中的用途。
[0019] 本发明的有益效果
[0020] 本发明在当地受污染水体中筛得一株优势富油栅藻SDEC-12(Scenedesmus bijugaSDEC-12)，该株藻可以较好的适应生活污水中的微环境并利用污水中的养分通过 规模培养源源不断地获得含油脂的生物质。本发明的栅藻SDEC-12在人工配制的生活 污水中生长迅速并获得高于BG-11培养基中的生物量，具有比较好的应用前景。另外本 发明的栅藻SDEC-12(ScenedesmusbijugaSDEC-12)具有较高的油脂积累特性，油脂含 量为27. 5 %高于其在BG-11培养基中的油脂含量18. 67 %，油脂产率为7. 88mg/L/d比 BG-ll(1.46mg/L/d)中的 5 倍还多。
【附图说明】
[0021] 图1 :栅藻SDEC-12在系统关系树中的位置。
[0022] 图2 :栅藻SDEC-12的显微形态学照片
[0023] 其中，（a)为光学显微照片（X1000)，（b)为透射电子显微照片（X30000)。C，叶 绿体；L，油脂；N，细胞核；S，淀粉粒；V，液泡；W，细胞壁。
[0024] 图3 :栅藻SDEC-12在BG-11培养基及人工配制的生活污水中的生长曲线。
[0025] 图4 :栅藻SDEC-12在BG-11培养基及人工配制的生活污水中的油脂产量及油脂 产率。
[0026] 图5 :栅藻SDEC-12对人工配制的生活污水中氮磷去除情况。
【具体实施方式】
[0027] 以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选 择。
[0028] 实施例1栅藻SDEC-12的分离鉴定：
[0029] 一、样品采集
[0030] 2012年12月11日从山东建筑大学映雪湖（受污染的湖泊）采集水样。
[0031] 二、栅藻SDEC-12的分离纯化
[0032] 分离纯化步骤：取回的水样离心浓缩后加入BG-11培养基进行扩大培养，大约7天 后通过血球板计数法在显微镜下计数，然后根据计数量将藻液密度稀释到约4000个/mL。 在超净实验台上，将已配置好的半固体培养基（BG-11培养液+0. 5-0. 6%琼脂）倒平板（已 放置过夜，无杂菌生长），将稀释后的藻液使用医用喉头喷雾器分别喷在标记好的平板上， 然后盖好，放在光照培养箱内培养十余天，待培养基上长出藻株菌落进行显微镜检。纯的藻 株用消毒过的接种环直接移植到装有100mLBG-11培养液并经过灭菌的三角烧瓶中，用纱 布及无菌膜封口，置于光照培养箱中培养。不纯的藻株采用改进的96孔板进一步分离纯 化：充分振摇培养基，如藻细胞成聚合体尽量使藻细胞群体分散为单细胞。在显微镜下用 血球计数板计数（浓度大时需稀释后重新计数），根据所计藻细胞密度，将培养液稀释至每 50yL含0