一种高产细菌素粪肠球菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高产细菌素粪肠球菌及其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着人们生活水平的不断改善和提高，乳制品的消费也日益增加，特别是一直不 太被人们接受的奶酪也逐渐成为人们日常饮食的一部分，新鲜奶酪是指原料乳、稀奶油、乳 清或他们的混合物经发酵剂发酵，凝乳酶凝乳，排除乳清所形成的产品。新鲜奶酪在制作工 艺上省去了发酵成熟这一步骤，从而使得其风味柔和清淡，含水量大于67%，质地介于酸奶 和奶酪之间，口感好，在国内消费者中的认可度最高。但是，奶酪中营养物质丰富，是多数微 生物生长繁殖的理想环境，尤其是致病菌和腐败菌。奶酪生产中频繁的手工操作也会造成 后加工的污染，新鲜奶酪对李斯特菌（L.Monocytogenes)的定植尤其敏感，特别容易受到 李斯特菌（L.Monocytogenes)的污染，造成微生物性食物中毒，严重影响人们的生活质量， 所以确保奶酪的安全性尤为重要。
[0003] 现阶段，人们主要通过添加化学防腐剂来控制食品中微生物的生长，延长食品的 保质期。但是这些化学添加剂长期的食用对人的心脏、血压和肾脏都有很不好的影响，甚至 有的化学添加剂会有致癌变、致突变和致畸性的不良作用。在食品的生产加工中也常常通 过热杀菌的方法来控制微生物的滋生，但是热杀菌的处理方式也存在着一些弊端，它会影 响食品的品质以及营养成分会受到破坏。虽然像紫外消毒、过滤除菌这些物理杀菌的方法 可以避免破坏食品的品质，但是包装在打开之后就很容易受到细菌的感染。所以开发出高 效、稳定、安全的天然生物防腐剂已经成为人们的迫切希望。
[0004] 乳酸菌广泛应用于食品工业，而且已经是人们经常消费的一类微生物，有的乳酸 菌在生长到一定阶段会产生细菌素，细菌素是一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质或者蛋白 质复合物物质，它可以有效的抑制大多数革兰氏阳性菌和致病菌的生长，具有良好的耐酸 和耐热能力，在体内可以被蛋白酶水解而消化，是很好的一类生物防腐剂。将乳酸菌细菌素 应用于新鲜奶酪加工中，奶酪的口感和味道都不会受到影响，还可以有效的抑制李斯特菌 (L.Monocytogenes)的生长。
[0005] 细菌素作为一类生物防腐剂在奶酪的应用具有巨大的空间，现阶段，商业化的细 菌素产品还很有限，开发出新型的细菌素已成为人们的期望。随着技术的不断提高，细菌素 将最终成为一种安全的天然生物防腐剂广泛应用于奶酪中。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种高产细菌素的粪肠球菌（Enterococcus faecalis)，命名为KLDS6001，分类命名为奠肠球菌（Enterococcusfaecalis)，保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院 微生物研宄所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo. 9966,保藏时间为2014年11月13日。
[0007] 本发明所提供的粪肠球菌是从传统的乳制品中分离而获得，在MRS固体培养基上 菌落形态为圆形、突起，色泽为乳白色、不透明，革兰氏染色为阳性，菌体形态为圆、短链状 排列，经16SrDNA鉴定为粪肠球菌。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种粪肠球菌细菌素以及生产该粪肠球菌细菌素的 方法。
[0009] 本发明所提供的细菌素是由本发明的粪肠球菌（Enterococcusfaecalis)发酵而 得到。具体的，包括以下步骤：
[0010] (1)粪肠球菌发酵液的制备
[0011] 将权利要求1所述的奠肠球菌（Enterococcusfaecalis)接种于MRS培养基中， 37°C，培养12-16h后得到粪肠球菌发酵液；
[0012] (2)粪肠球菌细菌素的初步纯化
[0013] 将步骤（1)得到的发酵液进行离心处理，并吸取上层清液，向该上层清液中加入 硫酸铵进行盐析，离心，收集沉淀，复溶于乙酸钠缓冲溶液中，即得到细菌素的粗提物；
[0014] (3)粪肠球菌细菌素的二次纯化
[0015] 将细菌素的粗提物进一步采用葡聚糖G-25凝胶层析柱进行分离纯化，即得纯化 后的细菌素。
[0016] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（1)用于培养奠肠球菌（Enterococcus faecalis)的MRS培养基成分如下：蛋白胨10. 0g、牛肉膏10. 0g、酵母粉5g、葡萄糖20. 0g、 吐温801.lg、磷酸氢二钾2. 0g、乙酸钠3. 0g、柠檬酸二胺2. 0g、硫酸镁0. 6g、硫酸锰0. 25g 以及蒸馏水l〇〇〇mL。
[0017] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（1)中的培养温度为37°C，培养时间为14h。
[0018] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（2)中按照以下方法进行初步纯化：按步骤 (1)得到的发酵液进行离心处理，并吸取上层清液，向该上层清液中加入饱和度为70%的 硫酸按进行盐析，l〇〇〇〇Xg，4°C离心30min，收集沉淀，复溶于pH6. 0的0. 02mol/L乙酸钠缓 冲溶液中，即得到细菌素的粗提物。
[0019] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（3)中采用葡聚糖G-25凝胶层析柱进行分 离纯化所用层析条件为：用50% (w/w)的氯化钠和50% (w/w)乙酸钠的缓冲液进行洗脱， 流速为lmL/min，样品上样量为400yL，收集保留时间在14-16min内的蛋白峰产物即为纯 化后的细菌素。
[0020] 研宄表明，将所述方法得到的细菌素以及含有细菌素的粪肠球菌发酵液以2 %添 加到含有1%李斯特菌的新鲜奶酪中，在储存的5天内，可以有效抑制李斯特菌的生长，且 新鲜奶酪的水分以及蛋白质含量无明显变化。
[0021] 此外，按照本发明所述方法制备得到的细菌素以及含有细菌素的粪肠球菌发酵 液，有很好的耐热能力，121°C处理30min仍保持抑菌活性，对酸稳定，在pH2. 5-7. 5的范围 内保持稳定的抑菌活力。胃蛋白酶、蛋白酶K、a-淀粉酶均可使细菌素部分失活。
[0022] 因此，本发明的第三个目的是提供所述的粪肠球菌细菌素或者含该细菌素的粪肠 球菌发酵液在抑制李斯特菌（L.Monocytogenes)生长中的应用。以及
[0023] 所述的粪肠球菌细菌素或者含有该细菌素的粪肠球菌发酵液在制备新鲜奶酪发 酵剂中的应用。
【附图说明】
[0024] 图1是细菌素对新鲜奶酪中李斯特菌的抑制情况；
[0025] 图2为新鲜奶酪的制作过程。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0027] 实施例1粪肠球菌的分离及鉴定
[0028] 本发明所提供的粪肠球菌是从传统的乳制品中分离而获得，在MRS固体培养基上 菌落形态为圆形、突起，色泽为乳白色、不透明，革兰氏染色为阳性，菌体形态为圆、短链状 排列。经 16SrDNA鉴定为奠肠球菌（Enterococcusfaecalis)。
[0029]所述的奠肠球菌（Enterococcusfaecalis)，命名为KLDS6001，分类命名为奠肠 球菌（Enterococcusfaecalis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研宄所，其菌种保藏编号为：CGMCC No. 9966,保藏时间为2014年11月13日。
[0030] 实施例2粪肠球菌细菌素的制备
[0031] (1)粪肠球菌发酵液的制备
[0032] 将粪肠球