一株新型嗜热耐盐降解原油产乳化剂的菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于能源生物技术和环境生物技术领域，具体地说，本发明是关于一株不 产氧芽孢杆菌（Anoxybacillusrupiensis)及其应用，该菌株能以原油和糖蜜为碳源和能 源生长，同时产生生物乳化剂，该菌株及其产生的生物乳化剂可用于微生物采油，提高采油 率。
【背景技术】
[0002] 石油是一种非再生资源，随着石油资源的日益短缺和勘探费用的不断增加，经 过一次采油和二次采油后，地层中仍然有约60% -70%的缘由无法开采出来。石油的短 缺已逐渐不能满足人们对石油资源有增无减的需求。近年来，以微生物提高原油采油率 (MicrobialEnhancedOilRecovery，ME0R)技术为代表的三次采油方法正逐渐受到广泛 重视。该技术利用微生物的有益活动及代谢产物来提高原油采收率，是继热力驱、化学驱、 聚合物驱等传统"三采"方法之后的一项综合性技术。
[0003] 微生物采油技术是一项科技含量高、发展迅猛的新技术，是现代生物和技术在采 油工程领域中开拓性的应用，对于高含水和接近枯竭的油田更显示出了强大的生命力。微 生物米油技术主要包括两类（RonaldM.Atlas.PetroleumMicrobiology[M].Newyork. Macmilanpress):-类是利用微生物代谢产物如生物聚合物和生物乳化剂作为油田化学 剂进行驱油，称为微生物地上发酵提高采收率工艺，即生物工艺法。目前该技术在国内外已 趋向成熟；另一类是利用微生物及其代谢产物提高采收率，主要利用微生物地下发酵和利 用油层中固有的微生物的活力，称为微生物地下发酵提高采收率方法。
[0004] 微生物以原油烃为碳源，代谢出生物乳化剂，生物乳化剂（如糖脂、磷脂、脂肽、月旨 肪酸、短肽等）是一些低分子量的小分子，它们能显著降低空气一水或油一水界面的张力， 从而有助于油水乳化，使得烷烃呈胶状分散，增加了烷烃与细胞的接触，提高微生物对烃的 降解效率。
[0005] 降解石油和高产有利代谢产物的微生物的分离是实现微生物强化采油技术的基 础，菌种的好坏是微生物采油的关键。目前已分离得到的一些石油微生物中，能在好氧或厌 氧条件下降解原油的嗜热耐盐同时能够产生物乳化剂的菌种不多。寻找合适的微生物仍是 本领域当前的一项重要工作。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对微生物采油现状，基于微生物采油的机理，提供一株能产 生生物乳化剂的菌株，该菌株同时具有很好降解和乳化原油的能力，改变原油流变性。
[0007] 本发明提供了一株能够在好氧或者厌氧条件下降解原油且产生乳化剂的菌株，其 是一株不产氧芽孢杆菌（Anoxybacillusrupiensis)，本发明命名其为WJ-4。该菌株已于 2012年09月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所），保藏编号：CGMCCNo. 6614。该菌 株能够以废弃原油和糖蜜为碳源和能源生长，并合成生物乳化剂；该生物乳化剂具有很强 的乳化能力、有效的提高烷烃或原油在水中的溶解度、明显促进菌株对原油的降解，该菌株 及其产生的生物乳化剂可用于微生物采油。
[0008] 本发明的AnoxybacillusrupiensisWJ-4是从大庆九厂的油水样中分离得到 的。参考《常见细菌系统鉴定手册》，根据WJ-4的生理生化特征，以及16SrDNA基因序列 在Genbank数据库中BLAST比对的结果，可鉴定WJ-4为不产氧芽孢杆菌（Anoxybacillus rupiensis)。WJ-4的生理生化特征，以及16SrDNA基因序列如下：
[0009] WJ-4菌在固体LB培养基上65°C培养ld，菌落呈圆形，乳黄色，隆起凸状，边缘 整齐，表面湿润。在光学显微镜1000倍下观察，菌体呈短杆状，细胞大小为（0. 5?1. 0) ymX(3. 2?5. 4)ym，有侧生鞭毛，产生芽孢，革兰氏染色为阳性，菌体染色和电镜图片见 图1。该菌均在50?80°C和0?15%NaCl溶液中生长良好，其最适生长温度为65°C，最适 盐的质量分数为3. 0%，见图2和图3。触酶、H2S实验、淀粉水解、纤维素水解、甲基红（MR) 实验均为阳性；苯丙氨酸脱氨、尿酶实验、氧化酶、溶菌酶抗性实验、络氨酸降解、吲哚实验、 明胶水解、络蛋白水解、V-P实验都为阴性，兼性好氧。
[0010] WJ-4菌的16SrRNA基因序列特征：用大连宝生物公司生产的DNA快速提取试剂盒 提取菌株WJ-4总DNA，采用大肠杆菌通用引物：27F, 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（SEQID 吣.2);14921?，5'-〇6611^〇：11^11^〇6六(：1'1'-3'（5￡0 10吣.3)，对町-4菌株165汕嫩序列进 行PCR扩增，反应体系（100yL)为：模板DNA1yL，Taq10x缓冲液 10yL，dNTPlOOmol/ L，DNA聚合酶2. 5U，引物各lyL。聚合酶链反应（PCR)条件为：于94°C预热5min;于94°C 变性30s，于58°C退火45s，于72°C延伸1. 5min并循环30次；于72°C延伸10min。然后， 将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，筛选阳性重组子送 大连宝生物公司测序，序列见SEQIDNo. 1。将整个序列提交到NCBI数据库GenBank进行 Blast比对发现：WJ-4与Anoxybacillusrupiensis菌株的最高同源性为99%。
[0011] 本发明还提供了一种不产氧芽孢杆菌制剂，该不产氧芽孢杆菌制剂中含有保藏编 号为CGMCCNo. 6614的不产氧芽孢杆菌，该不产氧芽孢杆菌制剂为固态或液态菌制剂。
[0012] 本发明还提供了所述的不产氧芽孢杆菌或所述的不产氧芽孢杆菌制剂在以废弃 原油和糖蜜为碳源发酵培养生产生物表面活性物质中的应用。
[0013] 本发明还提供了一种生物乳化剂，其是利用所述的不产氧芽孢杆菌或所述的不产 氧芽孢杆菌制剂发酵培养而得到的。
[0014] 本发明还提供了一种生产生物乳化剂的方法，该方法包括：利用所述的不产氧芽 孢杆菌或所述的不产氧芽孢杆菌制剂以废弃原油和糖蜜为碳源进行发酵培养，离心除去菌 体，将上清液用硫酸调pH至2. 0以下，并加入硫酸铵静置，再用氯仿和甲醇的萃取液等体积 萃取上清液，静置分层后，取下层，去除其中溶剂，制备得到生物乳化剂。具体地，该方法中， 所述发酵培养条件优选为：发酵培养基为：废弃原油5?10g/L、糖蜜l-3/L，NH4N03l?4g/ L、酵母膏 1 ?2g/L;K2HP043. 5g/L、MgS040. 2 ?0? 5g/L、pH7. 0 ?8. 0 的培养基中，50 ? 70°C，100?300rpm摇床培养90?180小时。
[0015] 本发明还提供了按照该方法制备得到的生物乳化剂。
[0016] 本发明还提供了所述的不产氧芽孢杆菌或所述的不产氧芽孢杆菌制剂在降解原 油和采油中的应用。
[0017] 本发明还提供了所述的不产氧芽孢杆菌、所述的不产氧芽孢杆菌制剂、或者所述 的生物乳化剂在驱油中的应用。具体的，在应用时，是将所述的不产氧芽孢杆菌在含有废弃 原油 5 ?10g/L、糖蜜 1-3/L，NH4N031 ?4g/L、酵母膏 1 ?2g/L;K2HP043. 5g/L、MgS040. 2 ? 0? 5g/L、pH7. 0?8. 0的培养基中，50?70°C，100?300rpm摇床培养90?180小时后， 将其发酵液用于驱油以提高原油采收率。
[0018] 本发明的WJ-4菌能够在高温高盐度的环境下生长和代谢，在好氧或厌氧条件下 具有很好的降解原油的能力。用WJ-4菌株生长细胞进行对好氧和厌氧的原油降解实验的 结果表明：WJ-4可有效降解并乳化原油，未接入菌体的原油培养基恒温培养后的水相仍然 是清澈的，油相呈大片油块漂浮在水溶液上层或黏附在瓶壁，两相完全隔离，油水界面清 晰。接入菌体的原油培养基培养l〇d后，油层分散在水相中呈细末状，瓶壁上没有黏附原 油，水相呈棕黑色，油水界面不清，静止后不分层。WJ-4对大庆稀油的降解率为33. 2 %。
[0019] 本发明提供的WJ-4菌株能够以废弃原油和糖蜜为碳源的基础培养基中发酵培养 生产生物乳化剂。培养基组成为（g/L):废弃原油5?10g/L、糖蜜l-3/L，NH4N03l?4g/L、 酵母膏1?2g/L;K2HP043. 5g/L、MgS040. 2?0? 5g/L、pH7. 0?8. 0。所产生的生物乳化剂 可以使去细胞去残余油的培养液的96小时乳化系数EI96仍可以达到95%，且乳化非常稳 定，表现出很强的乳化活性。
[0020] 本发明的WJ-4菌株产生的生物乳化剂，进行TLC实验，用硫酸-蒽酮显色后呈蓝 绿色，说明乳化剂样品中含有糖类成分；用茚三酮显色呈红色，说明表面活性剂样品中含有 蛋白组分；表面活性剂样品的丁酮抽提物用钼酸铵-高氯酸显色呈蓝-黑色斑点，说明表面 活性剂样品中含有脂类物质。WJ-4代谢产生的表面活性剂主要为糖类，可能是糖蛋白类生 物乳化剂。
[0021] 本发明的WJ-4菌所产的生物乳化剂具有很强的乳化活性，96小时乳化系数高达 95%，其降低表面张力的能力较弱，可见其主要起乳化稳定的作用。该结果表明能产生生物 乳化剂的嗜热耐盐WJ-4菌株至今未见国内外的相关技术报道。
[0022] 本发明的WJ-4菌株所产生的生物乳化剂具有明显的乳化能力。目前国际上对乳 化能力的测定，通常以煤油为乳化对象，在带刻度的试管中，加入5mL测试煤油和5mL乳 化活性物质溶液，祸旋振荡器充分振荡2min，静置一定时间，以乳化指数（Emusification index，EI)表示乳化剂的乳化活性。EI为油水界面上层高度占总高度的百分数。结果表明， 静置96小时后EI系数可以达到95%，且相对稳定，可见WJ-4产生的表面活性剂具有很高 的乳化能力。<