一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤 细胞的扩增培养方法。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞（naturalkiller cell，NK)，又称NK细胞，被认为是机体抗感染、 抗肿瘤的第一道天然防线，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节 有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞胞浆丰富，含有较 大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。NK细胞作用于靶细胞后杀伤 作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿 瘤细胞（包括部分细胞系）、病毒感染细胞、某些自身组织细胞（如血细胞）、寄生虫等，因 此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第II型超敏反应和移植物抗宿主 反应。活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤 靶细胞的作用。可见，NK细胞的培养具有十分重要的意义。
[0003] 目前大部分NK细胞培养体系采用胎牛血清加基础培养基培养，但是采用胎牛血 清培养会存在异源血清所带来的潜在危险。为此，也曾有报道用添加细胞因子IL-2或 IL-15的无血清培养基培养NK细胞以避免异源血清带来的风险，但扩增NK的效果不明显， 纯度相对较低；无法达到临床所需的细胞数量。
[0004] 因此，进一步研宄无异源血清的且能够大量扩增NK，并获得高纯度NK的培养基和 培养方法十分必要。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种自然杀伤细胞的培养基及自然 杀伤细胞的扩增培养方法。以本发明提供的培养基及扩增培养方法培养自然杀伤细胞扩增 效率高，纯度良好。
[0006] 本发明提供的扩增培养自然杀伤细胞的培养基，包括：无血清培养基、人血浆、 IL-2、IL-21、IL-15 和OKT-3。
[0007] 无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合 成培养基。无血清培养基的基本配方包括：胰岛素、转铁蛋白、纤粘连蛋白。
[0008] 人血浆即人体血液中的液体成分，人的血细胞悬浮于其中。本发明采用人血浆，降 低异源性血清存在的潜在危险。
[0009] 11-2即白细胞介素-2(1拉61'16111^11-2，11-2)，又名1'细胞生长因子〇'〇611 growthfactor，TCRF)。可促进NK细胞的增殖，维持NK细胞长期生长。
[0010] IL-21即白细胞介素-21 (interleukin-21，IL-21)，参与调节T细胞的增殖。
[0011] 几-15即白细胞介素-15(1拉61'16111^11-15，11-15)，生物学作用与11-2相似。
[0012] OKT-3为鼠源性抗人T淋巴细胞⑶3抗原单克隆抗体，目前未见OKT-3对NK细胞 活性或增殖特性影响的相关专利。
[0013] 在一些实施例中，IL-2的浓度为100U/mL?400U/mL。
[0014] 在另一些实施例中，IL-2的浓度为200U/mL?300U/mL。
[0015] 在一些实施例中，IL-21的浓度为5ng/mL?100ng/mL。
[0016] 在另一些实施例中，IL-21的浓度为40ng/mL?60ng/mL。
[0017] 在一些实施例中，IL-15的浓度为5ng/mL?100ng/mL。
[0018] 在另一些实施例中，IL-15的浓度为40ng/mL?60ng/mL。
[0019] 在一些实施例中，0KT-3的浓度为5ng/mL?100ng/mL。
[0020] 在另一些实施例中，0KT-3的浓度为40g/mL?60g/mL。
[0021] 在一些实施例中，人血浆的体积分数为5?15%。
[0022] 在另一些实施例中，人血浆的体积分数为10%。
[0023] 在一些实施例中，无血清培养基采用LONZAX-VIV0 15。
[0024] LONZAX-VIV0 15由L0NZA公司生产，目前常用于培养人类单核细胞、巨噬细胞细 胞、粒细胞或自然杀伤（NK)细胞，但对NK细胞的培养时，NK细胞扩增效果不佳。
[0025] 本发明通过在无血清培养基中添加人血浆、IL-2、IL-21、IL-15和0KT-3,提高了 NK细胞的扩增效率和扩增后的NK细胞纯度。与仅添加细胞因子IL-2和细胞因子IL-15的 对照组相比，本发明提供的培养基对NK细胞的扩增效率也有显著的提高。
[0026] 本发明还提供了一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，包括以下步骤：
[0027] 步骤1:从人外周血中分离自然杀伤细胞；
[0028] 步骤2 :以本发明提供的培养基重悬自然杀伤细胞，37°C，C02体积分数为5 %，培 养。
[0029] 在一些实施例中，培养为：每3天补充本发明提供的培养基使自然杀伤细胞的密 度为 0. 5X106个/mL?1. 0X10 6个 /mL。
[0030]作为优选，培养为：每3天补充本发明提供的培养基使自然杀伤细胞的密度为 0? 5X106个/mL〇
[0031] 每3天补充本发明提供培养基可以保证自然杀伤细胞在培养基中的量不至于过 高，从而避免NK细胞的增殖过早进入平稳期。采用本发明提供的方法，从第6天开始，NK细 胞增殖即进入对数期，在培养了 13天后NK细胞始终保持对数增长，在培养14天后，NK细胞 仍保持对数增长，且纯度维持在95%以上。说明本发明提供的方法能够有效提高NK细胞的 扩增效率，并能够使NK细胞的扩增较长时间的维持在对数期，且使细胞保持较高的纯度。
[0032] 在一些实施例中，重悬的自然杀伤细胞的密度为0. 5 X 106个/mL?1. 0 X 106个/ mL〇
[0033] 作为优选，重悬的自然杀伤细胞的密度为0. 5X 106个/mL。
[0034] 在一些实施例中，自然杀伤细胞的纯度不低于90%。
[0035] 作为优选，自然杀伤细胞的纯度为95%?96%。
[0036] 在本发明的实施例中，步骤1具体包括：以Ficoll淋巴分离液分离人血细胞获得 外周血单个核细胞，经分选获得自然杀伤细胞。
[0037] 本发明提供了包含无血清培养基、人血浆、IL-2、IL-21、IL-15和0KT-3的扩增培 养自然杀伤细胞的培养基。本发明提供的培养基用于扩增培养NK细胞，可以避免外源血清 带来的风险，扩增效率高且获得NK细胞纯度高。采用本发明提供的方法扩增NK细胞，能够 使NK细胞的扩增较长时间的维持在对数期。且培养获得的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性 良好。
【附图说明】
[0038] 图1示PBMC细胞和NK细胞的形态；其中，图1-a示PBMC形态（100倍）；图1-b 示NK细胞形态（100倍）；
[0039] 图2示分选前后细胞流式检测结果；其中，图2-a示分选前流式检测的结果；图 2_b示分选后流式检测的结果；
[0040] 图3示实施例6培养14天后的NK细胞的流式检测结果；
[0041] 图4示实施例6获得的NK细胞对K562细胞的杀伤活性。
【具体实施方式】
[0042] 本发明提供了一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法，本领 域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方 法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和 范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0043] 本发明采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0044] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0045] 实施例1本