miR319a2在调节白菜叶球形状中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物遗传学领域，具体地，本发明涉及miR319a2在调节白菜叶球形状 中的应用。
【背景技术】
[0002] 现今农业上的蔬菜品种从食用部位来看，可以分为叶类蔬菜，根茎类蔬菜和果实 类蔬菜。其中在叶类蔬菜中，叶球类蔬菜是一个重要的组成部分，其中较为常见的有结球白 菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis),结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L)和结球生菜（Lactuca sativa var.capitata L.)。结球白菜（又称大白菜），是亚洲地 区传统的蔬菜作物
[0003] 叶球作为该类蔬菜的储存器官，是其可食用部分，具有重要的农业价值和商品价 值。从形态上看，叶球是一种变态器官，由轮生的叶片相互抱合而成，叶子向内弯曲是叶球 发生的显著特征。
[0004] 已经知道，许多因素会影响植物叶球的发生和发育过程。生长素在叶片内的不均 衡分布、较低的温度和较大的昼夜温差、弱光、短日照以及充足的碳素营养都可以促进叶球 的发生和发育。因此，叶球的发生是一个复杂的生物学过程，是在环境因子诱导下的形态学 反应。在此过程中表达的基因是调控植物接受外界信号和展开发育活动的关键环节。
[0005] 以大白菜为例，在栽培条件下，大白菜需要一个长时间的营养生长来形成叶球，通 常这个时期可以分为4个部分：幼苗期，莲座期，包心期和结球期，通过叶形态的特点来划 分。在幼苗期，幼态叶生长并分化为成熟叶；在莲座期，展开的叶片通过提供光合作用产物 的方式辅助叶球形成。包心的叶片分化并向内弯曲为叶球形成提供架构和遮蔽，而叶球的 叶片紧紧地围绕茎尖形成储存营养物质的叶球。
[0006] 由于叶球是大白菜的主要食用器官，因此大白菜叶球发育的好坏决定了大白菜 的品质和农业价值。我国育种家采用传统的育种方法广泛开展大白菜类蔬菜品种的选育 工作，扩大资源来源途径，开展多种品种间的杂交组合，一定程度提高了白菜类蔬菜叶球性 状，并选育了大量抗虫抗病，快速生长的品种，在生产上已经发挥了作用。然而，传统的育种 学在原有的基础上进行品种的优选优育，但由于现有品种的局限性，传统的配置杂交组合 的育种方法受到了一定的限制性，为了适应农业生产的需要，采用新的技术手段来开发更 为早熟，结球品种更为多样化的的大白菜品种变得日益重要。此外，除了大白菜以外，对结 球甘蓝，结球生菜等其他叶球类蔬菜的叶球农业性状的改良，也具有十分重要的意义。
[0007]microRNA(miR或miRNA，微小RNA)是一类在较高等的真核生物体内广泛存在的， 长度约18-26个碱基的单链RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与一些mRNA上 的靶位点相结合，引起靶mRNA降解或翻译抑制，进而在转录后水平对靶基因进行调控。
[0008]microRNA来源于长度约lOOObp的长链RNA初始转录产物（Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60-80nt的具有茎环结构的miRNA 前体。前体miRNA转运至胞质后，被进一步切割成长约18-26nt的双链miRNA。双链miRNA 解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其表达。尽管microRNA在细胞 总RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地对所有具有靶位点的mRNA产生调控作用， microRNA在农作物品质改良中所起的作用不可小视。
[0009] 迄今为止，本领域对于影响白菜叶片和叶球形状性状相关的基因或调控机理了解 甚少，因此本领域迫切需要开发调节白菜叶球形状的物质及其应用。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种可调节白菜叶球形状的物质、手段及其应用。
[0011] 在本发明的第一方面，提供了一种微小RNA-miR319a2,所述的miR319a2具有如 SEQIDN0. :1所述的序列。
[0012] 在本发明的第二方面，提供了 一种用于产生本发明第一方面所述的微小 RNA-miR319a2的多核苷酸，所述的多核苷酸是序列如SEQIDN0. :3所示的编码序列。
[0013] 在本发明的第三方面，提供了一种miR319a2、或miR319a2活性片段、或miR319a2 的拮抗剂、或miR319a2的激动剂的用途，它们被用于调控白菜叶片的细胞分裂和/或调控 白菜叶球形状。
[0014] 在另一优选例中，所述的白菜包括大白菜、小白菜、甘蓝、生菜。
[0015] 在另一优选例中，所述的大白菜选自下组：结球白菜（Bre)。
[0016] 在另一优选例中，所述的调控白菜叶片的细胞分裂是指：调控白菜叶片的细胞分 裂速度。
[0017] 在另一优选例中，所述的调控白菜叶片的细胞分裂是增强白菜叶片的细胞分裂速 度。
[0018] 在另一优选例中，所述的调控白菜叶球形状是指：调控白菜叶球形状的叶球高度、 叶球直径、以及叶球指数（即叶球高度直径比）。
[0019] 在另一优选例中，所述的miR319a2具有如SEQIDN0. : 1所述的序列：
[0020] 5,-UUGGACUGAAGGGAACUCCCU-3,（SEQIDN0. :1)。
[0021] 在另一优选例中，所述用途还选自下组：还包括调控白菜的叶边缘结构、调控白菜 的叶面泡状结构、调控白菜的茎尖（顶端分生组织）的发育、或其组合。
[0022] 在另一优选例中，所述miR319a2的拮抗剂包括与miR319a2结合的海绵体、反义寡 聚核苷酸（如SEQIDN0. : 1的反义序列）、锁核酸、或抑制miR319a2表达的物质。
[0023] 在另一优选例中，所述的拮抗剂是序列如SEQIDN0. :2所示的核苷酸序列；或由 SEQIDN0. :2序列的串联形成的海绵体。
[0024] 在另一优选例中，所述miR319a2的激动剂为：促进miR319a2高表达（或超表达） 的物质。
[0025] 在本发明的第四方面，提供了一种调控白菜叶球形状的方法，所述方法包括步骤 ： 将表达miR319a2的表达载体导入所述白菜，从而在转基因的白菜中表达miR319a2。
[0026] 在另一优选例中，所述方法还包括：对所述转基因的白菜，进行叶球形状测定，并 与野生型白菜的叶球形状进行比较。
[0027] 在另一优选例中，所述方法还包括：对所述转基因的白菜，测量BrpTCP基因的表 达水平。
[0028] 在另一优选例中，所述的叶球形状测定包括测量叶球高度、叶球直径、以及叶球高 度直径比。
[0029] 在另一优选例中，所述的叶球形状测定包括测量白菜的叶边缘结构、或调控白菜 的叶面泡状结构。
[0030] 在另一优选例中，所述方法还包括：对于选出的叶球形状发生变化（或预定变化） 的白菜，测定其生长速度，从而挑选出改良的白菜品种。
[0031] 在本发明的第五方面，提供了一种载体，所述的载体携带表达本发明第一方面所 述的微小RNA-miR319a2的核酸序列。
[0032] 在另一优选例中，所述的核酸序列是序列如SEQIDN0. :3所示的核苷酸序列。
[0033] 在另一优选例中，所述的载体为表达载体。
[0034] 在本发明的第六方面，提供了一种植物细胞，所述的植物细胞含有本发明第五方 面所述的载体，或者其基因组中整合有表达本发明第一方面所述的微小RNA-miR319a2的 核酸序列。
[0035] 在另一优选例中，所述的植物细胞是叶球类植物细胞，较佳地是白菜的细胞。
[0036] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一赘述。
【附图说明】
[0037] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
[0038] 图1显示了拟南芥与大白菜的Brp-MIR319a和BrpTCP基因家族序列比对分析。其 中包括At_miR319a、Brp-miR319al和Brp_miR319a2等序列。
[0039] 图2显示了结球白菜不同叶球的表型以及miR319a2基因对白菜叶球形态的影响。 其中，图2A-2H为从结球白菜-不结球白菜重组自交系F6代植株中分离的四种大白菜叶 球表型。（2A)圆形叶球白菜，及其叶球（2E)，（2B)椭圆形叶球白菜，及其叶球（2F)，（2C) 圆柱形叶球白菜，及其叶球（2F)，（2D)圆锥叶球白菜，及其叶球（2F)，（21)野生型大白菜 品系Bre，及其叶球（2J)和顶端分生组织横切面（2K)，（2L)Bre与319a2转基因大白菜球 叶，（2M)Brp-MIR319a2转基因大白菜株系319a2-2,及其叶球（2N)和顶端分生组织横切面 (20)，（2P)319a2转基因大白菜叶边缘融合现象，及其切片（2Q)。
[0040] 图3显示了转基因大白菜319a2的表型。（3A)野生型和转基因大白菜319a2中 miR319a的Northern杂交，（3B)野生