一种抑制水霉菌的基因、含该基因的重组表达载体和重组工程菌以及基因的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种能够抑制水霉菌的基因、含该基因的重组工程菌以及该基因的重 组表达产物在水霉病防治中的应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 水霉病（Saprolegniasis)是世界性分布的淡水养殖动物疫病，各种淡水鱼类，从 鱼卵到成鱼都可发生，俗称"白毛病"。目前普遍认为鱼类体表受伤时，水霉孢子乘机入侵， 在病变部位附着并萌发出棉绒状菌丝，加重鱼虾负担，造成食欲不振，甚至瘦弱致死。高密 度养殖、鱼体受伤和温度骤降是主要诱发因素。水霉病（Saprolegniasis)主要致病菌为寄 生水霉，对淡水鱼类危害严重。
[0003] 水霉病的传统防治方法是使用化学药物防治，特别是化学染料孔雀石绿以其使用 简便、价格低廉、效果显著等优点，从上世纪30年代开始被广泛用于水产养殖产业中，曾经 发挥过积极作用。但由于孔雀石绿"两高"（高毒性、高残留）和"三致"（致癌、致畸、致突 变)，自上世纪90年代起已经在全世界各个国家相继禁止使用，我国也在2002年出台的相 关法律法禁止用于食用水产动物。后来虽然筛查多种化学药物，如甲醛、高锰酸钾、过氧化 氢、聚维酮碘、二硫氰基甲烷、戊二醛、三氯异氰尿酸等氧化剂或防腐剂以及多种重金属，用 于防治水霉病，但这些化学药物要么成本过高，要么有效浓度超过其安全使用浓度，随着我 国食品安全水平不断规范和提高，可用于防治水霉病的化学药物可选择范围会越来越少。
[0004] 枯草芽孢杆菌应用领域很广，在水产养殖领域也有大量应用，可用作饲料添加剂， 也可用作水质改良剂，用在鱼塘中净化水质。作为饲料添加剂时，能改善养殖对象体内微生 态环境，阻碍病菌入侵和定植，提高养殖对象的抗病能力。作为水质改良剂时，能大量消耗 水体中的有机质，同时可以与养殖环境中有害藻类以及水产致病菌竞争，形成优势种群，抑 制有害藻类及水产致病菌，净化水质。
[0005] 目前芽孢杆菌在水产养殖中的应用主要是上述两方面，未见将其用于水霉病防治 的应用性报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种能够抑制水霉的基因，该基因能够表达抑制水霉的物 质，对水霉病有很好的防治作用，且比化学药物使用更加安全。
[0007] 本发明的另一目的是提供含有该基因的重组表达载体和重组工程菌，该重组工程 菌抑制水霉的效果优于原始菌种。
[0008] 本发明的另一目的是提供了该重组工程菌在水霉病防治中的应用。
[0009] 为了得到对人类更为安全的防治水霉病的药物，发明人试图根据真菌与细菌的相 互拮抗作用，寻找能够抑制水霉真菌的细菌或细菌代谢产物。发明人选取多种细菌，测试各 菌种对水霉菌的抑制作用，结果显示，芽孢杆菌菌落的周围不会生长水霉菌，由此可以看出 芽孢杆菌对水霉菌具有直接的抑制作用。
[0010] 本发明以筛选的枯草芽孢杆菌>sM〇7i>s)TCCC11322为原始菌株，该芽 孢杆菌的代谢产物虽然对水霉菌表现出抑制作用，但是抑制作用有限。因此发明人经过进 一步的研究，寻找到了该芽孢杆菌中表达抑制水霉菌活性物质的基因，并将其与工程细菌 重组，使抑制水霉菌活性物质能够被高效表达，提高了抑制水霉菌效果，使其能更好的代替 化学药物大量用于水产养殖中。
[0011] 最终，发明人从该枯草芽孢杆菌中研究并得到了表达抑制水霉菌活性物质的特殊 基因，该基因具有如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列。
[0012] 进一步的，将该基因导入表达载体中，可以获得一种重组表达载体。所述重组载体 优选由上述基因和质粒PBSA43构建而得。
[0013] 进一步的，构建重组表达载体优选使用下述引物： 上游引物为：5' -CGCGGATCCGCCGCTGCAACCGG -3' 下游引物为：5' -CCCAAGCTTACAAGCCGACCGCAITCC-3' 进一步的，将上述重组表达载体导入表达菌株中，可以获得一种重组工程菌。所述重组 工程菌优选由上述重组表达载体转化入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)WB600中构建 而得。
[0014] 将所得的重组工程菌扩大培养，即可得到所需的抑制水霉的活性物质，扩大培养 方法包括：将重组工程菌放入活化培养基中活化，然后接种入发酵培养基中，再向发酵培养 基中加入卡那霉素，进行扩大培养，得菌悬液；将菌悬液离心，取上清液，为发酵菌液。
[0015] 上述方法中，活化和发酵时所用的培养基相同，组成如下：蛋白胨15-20 g，水解 酪素8-12 g，氯化钠4-6 g，蒸馏水补足至1000ml，121 ° C高压灭菌15分钟。
[0016] 上述方法中，在发酵培养基中加入的卡那霉素的用量为8-10ug/ml发酵培养基。
[0017] 上述方法中，活化时，将重组工程菌接种到活化培养液中，进行活化。一般在 28-30°C、150-200rpm摇床培养过夜即可完成活化步骤。
[0018] 上述方法中，将活化所得的活化液接种入发酵培养基中进行培养。接种量可按照 常规用量选择，例如1-5%。
[0019] 上述方法中，发酵培养的条件为：在28-30°C、150-200rpm培养24-40h。
[0020] 本发明还提供了上述抑制水霉囷的基因在制备防治鱼类水霉病中的生物制剂中 的应用。
[0021] 本发明还提供了防治鱼类水霉病中的生物制剂，该生物制剂可以以上述重组工程 菌为有效成分，也可以以该重组工程菌扩大培养所得的菌悬液或发酵菌液为有效成分。
[0022] 本发明从枯草芽孢杆菌中获取了一种能够抑制水霉的基因，通过基因重组技术将 该基因转化入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)WB600中构建重组工程菌，该重组工程菌 生产的活性物质能够对水霉有很好的抑制作用，并且其抑制作用超过原始芽孢杆菌本身， 效果显著。且该重组工程菌培养简单，成本低，使基因表达产物能代替化学药物大量用于水 产养殖中。
【附图说明】
[0023] 图1为芽孢杆菌TCCC11322对水霉菌抑制效果图。
[0024] 图2为芽孢杆菌TCCC11322无菌上清液对水霉菌抑制效果图，图中，1和2为芽孢 杆菌TCCC11322无菌上清液，3为无菌水，4为空白PDB培养基。
[0025] 图3为pBSA43质粒图谱。
[0026] 图4为突变基因的电泳图片，图中1为D2000 DNA marker，2和3.为突变基因。
[0027] 图5为双酶切后的pBSA43质粒和突变基因的电泳图片，图中1为D15000 DNA marker，2为未酶切的pBSA43质粒，3为酶切的pBSA43质粒，4为未酶切的突变基因，5和6 为I和"i/?dIII双酶切的突变基因。
[0028] 图6为重组工程菌提取质粒扩增的电泳图片，图中1为D2000 DNA Marker，2为空 质粒PBSA43转化WB600, 3-6为重组表达质粒转化WB600, 7为纯WB600。
【具体实施方式】
[0029] 下面对本发明进行进一步详细的描述和说明，以使本领域技术人员能更好的理解 本发明以及本发明的优势。
[0030] 下述实施例中，所用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) WB600购自上海北 诺生物科技有限公司。大肠杆菌DH5a购自Invitrogen公司。质粒pBSA43在专利 CN201310097836. 3中已经详细描述了构建方法，本领域技术人员能够实现。
[0031] 下述实施例中，所用的限制性内切酶、聚合酶、连接酶以及所涉及的buffer购自 Themo公司。
[0032] 下述实施例中，DNA Marker :D2000 DNA Marker :鼎国公司和天根（Tiangen)公司； D15000 DNA Marker:天根（Tiangen)公司。
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