一种分泌大肠杆菌素v的重组植物乳杆菌及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物分子生物学领域，具体涉及一种分泌大肠杆菌素V的重组植物 乳杆菌及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近50年来，抗生素作为应用最普遍的防病促生长类饲料添加剂，在给养殖业带来 利益的同时，也带来了致命的弊端：动物肠道菌群失调、二重感染以及细菌耐药性等不良反 应逐渐凸显，给养殖业和饲料工业带来严重威胁。因此，开发无毒副作用、无污染和无残留 的抗生素替代品，成为科研工作者的当务之急。20世纪八十年代以来，以乳酸菌为主的微生 态制剂开始受到关注，其促进肠道有益菌的生长，抑制有害菌的生长，提高动物健康水平， 激发动物潜在的生长性能的功能逐渐被报道，此外又由于具有对环境无污染、无残留和无 毒副作用的优势，被认为是饲用抗生素最理想的替代品。
[0003] 乳酸菌是动物微生态制剂中使用最多的益生菌，属肠道正常菌群。植物乳杆 菌BM-1(Isolationandpartialcharacterizationofabacteriocinproducedby LactobacilluspiantarumBM-1isolatedfromatraditionallyfermentedChinese meatproduct.ZhangHetal. 2013)属于乳杆菌科中的乳杆菌属，厌氧或兼性厌氧，属同 型发酵乳酸菌，它能在肠道内定植，是形成生理屏障的主要组成部分。同时该菌株还分泌片 球菌素PA-1，片球菌素PA-1是一种IIa类细菌素，它是细菌代谢过程中由核糖体合成的一 类具有生物活性的多肽类物质，对致病菌单核细胞增生李斯特氏菌有强烈的抑制作用，因 其高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性及良好的生物相容性等优点，得到国内外学者的关 注。片球菌素PA-1在生物饲料添加剂、生物兽药的研发中有着广泛的应用价值和广阔的应 用前景。
[0004] 目前，微生态制剂研宄开发正向着高效、专一制剂的方向发展，通过基因工程技术 构建的工程菌株具有易于生产、保存、定植、繁殖或者能够针对某个阶段某种疾病的特点， 其效果更加显著，已成为生物技术领域的研宄热点。现有技术中，植物乳杆菌所分泌的片球 菌素PA-1对单核细胞增生李斯特氏菌有强烈的抑制作用，但对于革兰氏阴性致病菌无抑 制作用，而与其同为IIa类的细菌素大肠杆菌素V由革兰氏阴性菌分泌并对近源大肠杆菌 菌株有抑制作用，它的合成和分泌机制同片球菌素PA-1类似，由四个基因控制，分别编码 细菌素的前体肽，细菌素专用的ABC分泌系统和保护分泌菌株的免疫蛋白。其中IIa类细 菌素的前体肽的N段有一段双甘氨酸型导肽，在细菌素分泌过程中起重要作用，它能够引 导前体肽被ABC转运蛋白识别，并在分泌过程中被切割。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种能同时抑制李斯特氏菌和大肠杆菌的乳酸菌重组菌株， 该菌株利用了植物乳杆菌BM-1的片球菌素PA-1分泌系统来分泌大肠杆菌素V，使得两种细 菌素在植物乳杆菌中同时表达，为食品工业提供抗菌谱更广泛的基因工程菌株。
[0006] 本发明首先提供一种重组载体，该重组载体携带有片球菌素导肽基因和成熟大肠 杆菌素V基因连接而成的融合基因。
[0007] 所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1示。
[0008] 本发明提供了制备上述重组载体的方法，包括如下步骤：
[0009] (1)将片球菌素导肽基因和和编码大肠杆菌素V成熟蛋白的基因连接，合成融合 基因，两端添加酶切位点，构建在载体上；
[0010] ⑵分别双酶切表达载体和步骤⑴获得的携带合成基因的载体，酶切后，将二者 连接；
[0011] (3)连接产物电转化感受态细胞，提取质粒，得到测序正确的质粒。
[0012] 上述方法中，步骤（1)所述片球菌素导肽基因的序列如SEQIDNO. 2所示；大肠杆 菌素V成熟蛋白的基因序列如SEQIDNO. 3所示；合成的融合基因的序列如SEQIDNO. 1 所示；融合基因两端添加的酶切位点为NcoI和EcoRI，载体为pUCK。
[0013] 上述制备重组载体的方法中，步骤（2)的表达载体为P118148,其是将表达载体 PNZ8148上的启动子PnisA替换为P11获得，该载体还包含氯霉素抗性基因。其中，步骤（2) 的双酶切使用NcoI和EcoRI。
[0014] 其中，步骤（3)的感受态细胞为乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞。
[0015] 在本发明的实施例中，本发明提供的携带有片球菌素导肽基因和成熟大肠杆菌素 V基因连接而成的融合基因的重组载体命名为P118148-C01V。其是通过以下步骤构建得 到：
[0016] (1)将片球菌素导肽基因和成熟大肠杆菌素V基因连接，合成融合基因，两端添加 酶切位点NcoI和EcoRI，构建在pUC载体上；所述融合基因序列如SEQIDNO. 1所示；
[0017] (2)分别用NcoI和EcoRI双酶切表达载体pi18148和步骤⑴获得的携带合 成基因的载体，酶切后，将二者连接；
[0018] (3)连接产物电转化乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞，提取质粒，得到测序正确 的质粒pll8148-ColV。
[0019] 本发明还提供了含有上述重组载体的宿主细胞。
[0020] 进一步，本发明提供一种分泌大肠杆菌素V的重组植物乳杆菌，含有本发明的上 述重组载体。
[0021] 本发明提供该重组植物乳杆菌，通过以下步骤制备得到：
[0022](1)获得携带有片球菌素导肽基因和成熟大肠杆菌素V基因连接而成的融合基因 的重组载体；
[0023] (2)将步骤⑴的重组载体电转化入植物乳杆菌BM-1中。
[0024] 植物乳杆菌BM-1为野生型菌株含有片球菌素合成和分泌的基因，但不含大肠杆 菌素V相关的基因。
[0025] 本发明还提供了上述重组载体或重组植物乳杆菌在制备微生态制剂中的应用。
[0026] 本发明提供了重组植物乳杆菌在食品工业中的应用。
[0027] 含有本发明的重组植物乳杆菌的微生态制剂或饲料也属于本发明的保护范围。
[0028] 植物乳杆菌BM-1分泌的片球菌素PA-1是一种IIa类细菌素，其对单核细胞增生 李斯特氏菌具有强烈的抑制作用，而对革兰氏阴性致病菌没有抑制作用。由于其抑菌谱较 窄导致其在饲料和食品领域的应用具有一定的局限性。本发明选择了同为IIa类细菌素， 并且导肽序列和片球菌素相似的大肠杆菌素V作为目的基因在植物乳杆菌BM-1中进行表 达，使得该菌株同时分泌两种细菌素。经检测，该重组菌株发酵上清液对单增李斯特氏菌和 大肠杆菌均具有很好的抑制作用该重组菌株应用在饲料工业中能够抑制宿主的炎症反应， 降低仔猪的腹泻率，且不会产生毒副作用和残留，对环境和食品安全没有威胁。由于植物乳 杆菌能够定植于肠道内，在其发挥益生作用的同时，使得两种细菌素能够原位使用，并且细 菌素的复合使用也拓宽了抑菌谱，使抑菌效果增强，使得该重组菌株的应用领域将更加广 泛。
【附图说明】
[0029] 图1重组质粒pll8148-C〇lV的构建示意图，P11启动子替换了原来的PnisA启动 子，Pediocin LP为片球菌素的导肽。
[0030] 图2重组植物乳杆菌发酵上清液对大肠杆菌DH5 a的抑制作用，A :重组菌株上清 对大肠杆菌DH5 a有抑制作用，表明大肠杆菌素V成功；表达B :转入空载体的对照组对大 肠杆菌DH5a没有抑制作用。
[0031] 图3为重组植物乳杆菌发酵上清液对单增李斯特氏菌的抑制作用。A:重组菌株 上清液对单增李斯特氏菌有抑制作用，表明大肠杆菌素V的表达没有影响该菌株片球菌素 PA-1的表达；B:转入空载体的对照组对单增李斯特氏菌有抑制作用。
【具体实施方式】
[0032] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0033] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 本发明的乳酸乳球菌NZ9000和质粒pNZ8148是Nizo研宄公司的NICE系列产品，在MoBi Tec公司的网站上可以买到，具体说明书为《NICE? Expression System for Lactococcus lactis. The effective&easy-t〇-〇perate Nisin Controll