在毕赤酵母中使用甲醛脱氢酶启动子指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白l1表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种在甲醇营养型毕赤酵母宿主细胞 中使用毕赤酵母甲醛脱氢酶（FLD)启动子指导人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白LI(HPV 16L1)表达的方法。
【背景技术】
[0002] 毕赤酵母表达系统能有效地分泌异源蛋白，并进行真核翻译后修饰，操作简便易 于实现高密度发酵，且不产生内毒素及哺乳动物细胞核酸成分等，因此，是一个广泛应用的 蛋白表达系统。转录是基因表达调控最关键的环节之一，启动子可显著影响异源基因转录 的起始、水平及持续，从而直接影响异源蛋白的表达效率。毕赤酵母中最常用、最经典的启 动子是醇氧化酶1型启动子(AOX1)，该启动子具有严格的甲醇调控能力，使用毕赤酵母醇 氧化酶1型启动子已成功指导了上百种重组蛋白的表达。尽管醇氧化酶1型启动子能够指 导异源蛋白大量表达，但由于甲醇有毒且易燃，为安全和大规模生产带来问题，同时并不是 所有异源蛋白都适合这样高水平的表达调控，如果蛋白的正确折叠和加工是蛋白分泌途径 上的限速步骤，那么单位时间内大量表达的异源蛋白由于来不及进行修饰折叠，最终导致 这些未成熟的蛋白进入泛素化降解途径，相反地使蛋白产量降低。
[0003] 因此避免甲醇的使用寻找另一些替代的启动子则是一个有效的策略。毕赤酵母甘 油醛3-磷酸脱氢酶启动子（GAP)是另一个常用的毕赤酵母启动子，该启动子属于组成型启 动子，无需诱导，对于无毒性蛋白的表达具有简便、经济的优势。
[0004] 尽管组成型启动子简化了生产步骤，但若获得较高的蛋白产量，对菌体的生长状 况要求较高，并且其调控途径比较单一，蛋白表达的种类受限。因此一个强的具备多种调控 途径的启动子具有很好的开发应用价值，对于异源蛋白的表达研宄具有重要意义。
[0005] 在毕赤酵母中，谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶（FLD)启动子就是一个具备多种调控 途径的启动子。甲醛脱氢酶是参与酵母甲醇代谢和烷胺类物质代谢途径的主要酶。从毕赤 酵母中分离得到的甲醛脱氢酶基因编码379个氨基酸，与n-烷烃-同化酵母麦芽糖假丝 酵母的甲醛脱氢酶和人类及其它真核生物的脱氢酶III类酶的甲醛脱氢酶分别具有71%和 61%?65%的核苷酸序列同源性。甲醛脱氢酶将醇氧化酶氧化甲醇产物甲醛氧化，甲醛氧化 产物经甲酸脱氢酶后变为二氧化碳。甲醛脱氢酶同时参与烷胺类物质代谢，胺类物经胺类 氧化酶氧化形成甲醛，之后经甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶87作用后，产生二氧化碳并同化为 生物量。甲醛脱氢酶的合成可以独立地被以甲醇作为唯一碳源和能源，或以甲胺作为唯一 氮源调控。在葡萄糖和铵盐离子培养基中，甲醛脱氢酶表达水平很低；然而在甲醇-铵离子 或葡萄糖-甲胺培养基中，甲醛脱氢酶表达水平却很高。
[0006] 甲醛脱氢酶启动子已成功用于一些蛋白在毕赤酵母中的表达。使用甲醛脱氢酶启 动子可以使成熟形式的米根霉脂肪酶获得高水平的表达量，最大产量达386AU/ml，克服了 醇氧化酶1型启动子指导的米根霉脂肪酶的过表达对细胞生长带来的负效应，突破了米根 霉脂肪酶的分泌瓶颈。使用甲醇作为碳源和甲胺作为氮源的组合对蛋白产量具有协同增强 效应，而甲醇和硫酸铵碳氮源组合培养基则显示出最好的表达能力，在发酵培养基中表达 米根霉脂肪酶可达到300WT1的产量。然而甲胺作为氮源，当同作为碳源的山梨醇组合使用 时也能很好地诱导米根霉脂肪酶的表达。研宄表明，无论是以甲醇或是甲胺进行诱导，甲醛 脱氢酶启动子的强度均不弱于毕赤酵母醇氧化酶1型启动子。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种在甲醇营养型毕赤酵母中使 用甲醛脱氢酶启动子调控人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1表达的方法，其中人乳头瘤 病毒16型主要衣壳蛋白L1的表达受毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子的控制。
[0008] 本发明采用的技术方案如下： 毕赤酵母甲醛脱氢酶启动子指导的毕赤酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤： 步骤（1)，将甲醛脱氢酶启动子基因片段进行PCR扩增，扩增后的基因片段纯化后，亚 克隆进TA克隆载体pMD?18-T，得到Z^m-pMDTmIS-T载体； 所述的PCR扩增引物为：上游引物（5'端）为gtagatctgcatgcaggaatctctggca，下游引 物（3> 端）为gtgaattcgagacctgtgaatatcaagaattgtatga; 步骤（2 )，将步骤（1)得到的Z^m-pMDTmIS-T载体和毕赤酵母质粒pPink-HC进行双酶切， 连接酶连接过夜，得到质粒pPinkFLD-HC; 步骤（3)，将步骤（2)得到的质粒pPinkFLD-HC和毕赤酵母质粒pPinkAOXl-HPV16Ll进 行双酶切，连接酶连接过夜，得到连接产物质粒pPinkFLD-HPV16Ll; 步骤（4)，步骤（3)得到的连接产物质粒pPinkFLD-HPV16Ll转化大肠杆菌DH5a扩增 后，用限制性内切酶I酶切，纯化回收酶切线性化质粒； 步骤（5 )，将步骤（4 )得到的纯化回收的酶切线性化质粒电转化毕赤酵母PichiaPink^^trai/? /感受态细胞，经过毕赤酵母腺嘌呤缺陷平板筛选得到质粒 pPinkFLD-HPV16Ll表达克隆子。
[0009] 进一步，优选的是所述的PCR扩增的反应体系包括2微升lOXExtaq酶缓冲液， 1. 6微升dNTP混合物，50微摩尔浓度的上、下游引物各0. 25微升，0. 5微升Extaq酶，2微 升毕赤酵母细胞系GS115菌液，双蒸水13. 4微升； 所述的PCR扩增反应条件为95 °C，预变性3分钟；72 °C，热启动2分钟，同时，向反应体 系中加入高保真taq酶；之后95°C，变性30秒；52°C，退火40秒；72°C，延伸1分钟；最后 72 °C，再延伸10分钟，共34个循环。
[0010] 进一步，优选的是步骤（2)的具体操作如下：用限制性内切酶ifejn和 ifeal(+fe〇RI)双酶切步骤（1)得到的/^-pMDTM18-T载体后所得甲醛脱氢酶启动子片 段PFU)，与限制性内切酶你711和feoRI双酶切质粒pPink-HC所得载体以T4连接酶16°C 连接过夜，转化，涂板，得到质粒pPinkFLD-HC; 酶切质粒/^-pMD?18-T反应体系为：质粒i%-pMD?18-T0. 56yg/y1 10微升， 你/IIl微升，feaI(+^boRI)l微升，10XTbuffer3微升，0?l%BSA0?3微升，双蒸水 14. 7微升； 酶切质粒pPink-HC反应体系为：质粒pPink-HC0. 73yg/y1 10微升，MI1. 5微 升，feoRI1. 5微升，10XHbuffer3微升，双蒸水14微升； 连接反应体系为：片段PFU)1微升，载体1微升，10XT4buffer1微升，T4连接酶1微 升，双蒸水6微升；其中，片段PFU)和载体的连接摩尔浓度比为1:3。
[0011] 进一步，优选的是步骤（3)的具体操作如下： 步骤（2)得到的质粒pPinkFLD-HC用限制性内切酶I和fcaI(+feoRI) 双酶切消化后所得核苷酸片段与用限制性内切酶I和I双酶切的质粒 pPinkA0Xl-HPV16Ll所得载体，以T4连接酶16 °C连接过夜，转化，涂板，得到质粒 pPinkFLD-HPV16Ll； 酶切质粒pPinkFLD-HC:质粒pPinkFLD-HC0? 65yg/y1 10 微升，I1 微升，也31(+及^1)1微升，10\册8131^€6143微升，100\85六0.3微升，双蒸水14.7微升 ； 酶切质粒pPinkA0Xl-HPV16Ll:质粒pPinkA0Xl-HPV16Ll0? 65yg/y1 15 微升， I1微升，feoRI1微升，10XTbuffer3微升，0? 1%BSA0? 3微升，双蒸水9. 7微升； 连接反应体系为：核苷酸片段1微升，载体2微升，10XT4buffer1微升，T4连接酶1 微升，双蒸水5微升；其中，核苷酸片段和载体的连接摩尔浓度比为1:3。
[0012] 进一步，优选的是步骤（4)的质粒pPinkFLD-HPV16Ll酶切反应体系为：质粒 pPinkFLD-HPV16Ll0.373yg/yl15 微升，1.2 微升，lOXMbuffer3 微升，双蒸水 10. 8微升。
[0013] 本发明还体佛那个一种在毕赤酵母中使用甲醛脱氢酶启动子指导HPV16L1表达 的方法，该方法是使用上述得到的质粒pPinkFLD-HPV16Ll表达克隆子进行表达，具体步骤 如下： 步骤（1 )，将质粒pPinkFLD-HPV16Ll表达克隆子接种甘油复合物缓冲液培养基培养过 夜至菌液600纳米波长处吸光值为2~6之间，然后使用甲醇复合物缓冲液培养基进行诱导 表达，将有表达的菌落保存作为种子甘油菌； 步骤（2)，将步骤（1)得到的种子甘油菌接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中培养，所 得一级种子液再接种至甘油复合物缓冲液培养基获得二级种子液，将二级种子液分为等量 8份后使用8种不同诱导培养基培养，其中8种诱导培养基分别为葡萄糖-硫酸铵混合培 养基、葡萄糖-甲胺混合培养基、甘油-硫酸铵混合培养基、甘油-甲胺混合培养基、山梨 醇-硫酸铵混合培养基、山梨醇-甲胺混合培养基、甲醇-硫酸铵混合培养基和甲醇-甲胺 混合培养基； 步骤（3)，取步骤（2)中8种不同培养基诱导后24小时、48小时和72小时的酵母