选择和扩增多核苷酸的方法
【专利说明】选择和扩増多核苷酸的方法
[0001] 本申请是申请日为2009年8月25日，申请号为200980162143.X，发明名称为"选 择和扩增多核苷酸的方法"的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及核酸扩增领域。更具体地说，本实施方案提供了在固相载体上选择核 酸样本的一个或多个区域以及直接在固相载体上生长核酸聚类（cluster)同时消除对多 样本滴定步骤的需要的方法。
【背景技术】
[0003] 本申请中引用了若干公开物和专利文件以更加完整地描述本发明所属领域的状 态。这些公开物和文件的各自全部公开内容被引入本文作为参考。
[0004] 高通量核酸测序的许多方法依赖于通用的扩增反应，其中DNA样本被随机片段 化，然后处理，使得不同片段的末端都包含相同的DNA序列。含有通用末端的片段然后可以 使用单对扩增寡核苷酸在单一反应中扩增。在扩增前将片段库分离到单一分子水平确保扩 增分子形成离散群落，之后可以对其进一步分析。此类分离可以在乳液中或在表面上进行。 或者，可以设计对核酸样本的某部分具有特异性的扩增寡核苷酸，因而除去修饰样本末端 的需求。
[0005] 多核苷酸阵列基于"固相"核酸扩增而形成。例如，可以使用桥式扩增反应，其中固 定在固相载体上的模板被扩增，扩增产物在固相载体上形成以形成包含核酸聚类或"克隆" 的阵列。此类阵列上的各个聚类或克隆由多个相同的固定的多核苷酸链和多个相同的固定 的互补多核苷酸链形成。这样形成的阵列在本文中一般被称作"聚类阵列"。
[0006] 与其他数种扩增技术相同，固相桥式扩增使用正向和反向扩增寡核苷酸，其包括 "模板特异性"核苷酸序列，它们在扩增反应退火步骤的条件下能够与待扩增的模板或其互 补者中的序列退火。模板中在扩增反应条件下与引物退火的序列，在本文中可以被称作"引 物结合"序列。
[0007] 聚类方法的某些实施方案使用"通用的"引物来扩增可变的待扩增的模板部分，所 述模板部分的5'和3'端与常用或"通用的"引物结合序列相接。"通用的"正向和反向引物 包括能够与模板构建物中的"通用的"引物结合序列退火的序列。可变的模板部分或"靶" 自身可以是已知、未知或部分已知的序列。这一方法具有的优点是不必为待扩增的各个靶 序列设计特异性引物对；假使各个模板通过在其5'和3'端添加了相同的通用引物结合序 列而被修饰，相同引物可被用来扩增不同的模板。因此，可变的靶序列可以是感兴趣的任意 DNA片段。假使混合物中的各个模板分子通过添加相同的通用引物结合序列而被修饰，可以 使用类似方法通过使用单对通用的正向和反向引物来扩增多模板（具有已知末端的靶）的 混合物，例如多个靶核酸分子（例如基因组DNA片段）或靶核酸分子库。
[0008] 此类PCR扩增特别是固相桥式扩增的"通用引物"法是有益的，因为它们使得相同 或不同、序列已知或未知的多个模板分子能够在单个扩增反应中扩增，所述反应可以在具 有单对"通用"引物的固相载体上进行。不同序列的模板的混合物的同时扩增，还可以使用 多个引物对进行，每个引物对与混合物中的各独特模板互补。对模板的复杂混合物而言，为 各个独立的模板生成多个引物对可能是繁琐且昂贵的。在某些应用（例如检测病毒或微生 物感染的存在，或表征微生物群落）中，可能可以设计扩增寡核苷酸，使得仅有来自该微生 物的核酸被扩增。
[0009] 在聚类阵列的制备中，通常使用的模板浓度越高，在聚类阵列上产生的聚类密度 将越高。如果聚类密度太高，可能难以单独地解析各个聚类，并可能形成重叠的克隆。可以 进行滴定来确定最佳模板浓度，以在阵列上达到最佳聚类密度，其中的各个聚类可以单独 被解析。但是，此类滴定可导致聚类密度太高或太低引起的有价值流通池（flowcell)通 道的损失、模板样本损失、需要的试剂量增加、或样本处理时间增加。
[0010] 因此，对控制和达到所需聚类密度的方法存在需求，其不依赖于原始核酸样本浓 度而且避免了核酸滴定步骤。本发明满足了这一需求，而且还提供了其他优点。
【发明内容】
[0011] 本发明在某些实施方案中提供了选择和扩增多核苷酸的方法。该方法可包括（a) 提供具有多个模板多核苷酸的核酸样本；(b)提供固定在固相载体上的多个寡核苷酸，其 中所述多个寡核苷酸包括（i)多个捕获寡核苷酸，每个捕获寡核苷酸具有能够与所述核酸 样本的选定区域杂交的不同序列，和（ii)多个扩增寡核苷酸，其中所述捕获寡核苷酸以比 所述扩增寡核苷酸低的密度固定；(C)在使得所述模板多核苷酸选择性地与所述捕获寡核 苷酸杂交的条件下，将所述模板多核苷酸加至所述固相载体；（d)延伸所述捕获寡核苷酸， 以生成与所述模板多核苷酸互补的延伸产物；和（e)使用固定在所述固相载体上的一个或 多个扩增序列扩增该延伸产物。
[0012] 在一特定方面，本发明提供了控制在固相载体上形成的扩增的单链多核苷酸的序 列和克隆密度的方法。该方法可以包括以下步骤：(a)提供多个模板多核苷酸；(b)提供固 定在固相载体上的多个（至少三个）寡核苷酸，其中至少一个寡核苷酸是能够与所述模板 多核苷酸杂交的捕获寡核苷酸，而且至少两个寡核苷酸是不能与所述模板多核苷酸杂交的 扩增寡核苷酸，其中所述捕获寡核苷酸以比所述扩增寡核苷酸低的密度固定，而且所述捕 获寡核苷酸对所述多个模板多核苷酸中的一部分具有选择性；（c)在合适的条件下将所述 模板多核苷酸加至固相载体，使得所述模板多核苷酸分子选择性地与所述捕获寡核苷酸杂 交；（d)使用核酸聚合酶延伸所述捕获寡核苷酸，以生成与所述单链模板多核苷酸互补的 双链延伸产物；（e)变性所述双链延伸产物，以从所述延伸产物中除去杂交的单链多核苷 酸模板分子，以产生固定在所述固相载体上的单链模板分子；和（f)使用固定在所述固相 载体上的两个或多个扩增寡核苷酸，扩增固定在所述固相载体上的单链模板分子；其中所 述固定的克隆的密度被所述捕获寡核苷酸的密度而不是所述单链模板多核苷酸的浓度所 控制。
[0013] 本发明在某些实施方案中还提供了均匀移植了多个寡核苷酸的流通池，其中所述 多个包含具有不同序列的四种寡核苷酸，其中四种中的两种（例如第一和第二种）的存在 密度低于其他两种（例如第三和第四种）。
【附图说明】
[0014] 图1显示了本发明的方法，其中捕获寡核苷酸比扩增寡核苷酸长，而且模板选择 性地与延伸到扩增寡核苷酸之外的捕获寡核苷酸杂交。捕获寡核苷酸相对于模板链进行延 伸，变性并除去模板链。固定的模板拷贝可以与固定的扩增寡核苷酸之一杂交，且扩增寡核 苷酸可以延伸。捕获寡核苷酸还包含对应于扩增寡核苷酸之一的序列，因此通过从固定的 模板拷贝合成双螺旋，固定的双螺旋的两端可同时包含与扩增寡核苷酸之一互补的序列。
[0015]图2显示了制备适合扩增的单链模板库的示例性方法。
[0016] 图3显示了本发明的示例性方法，其中，初始时，扩增寡核苷酸之一被封闭以阻止 进行链的延长。在固定的模板链延伸后，除去封闭，样本可以进行桥式扩增循环。
[0017] 图4显示了带有两种不同的固定扩增寡核苷酸和一种捕获寡核苷酸的示例性的 固相载体。
[0018] 图5显示了核酸样本片段化为包含选定靶区域的多个多核苷酸。通过片段化，一 些片段包含靶区域，从而为随后的捕获提供模板，而其他片段不包含靶区域，因此不能成为 模板。片段可在一端与转接子连接。转接子可与载体上的扩增寡核苷酸之一互补或相同。
[0019] 图6显示了来自图5的模板多核苷酸样本与载体的杂交。样本通过靶区域与捕获 寡核苷酸杂交，样本中剩下的不含靶区域的分子未杂交，且可从载体上被洗掉。载体上捕获 的分子可用作模板多核苷酸。
[0020] 图7显示了已捕获了来自图6的模板多核苷酸的捕获寡核苷酸可以延伸，以生成 与模板多核苷酸互补的延伸产物。模板多核苷酸可以被变性。如果模板携带转接子序列， 转接子序列作为延伸的一部分被复制。如果转接子序列的拷贝与扩增寡核苷酸互补，可以 使用载体上的扩增寡核苷酸来扩增延伸产物。
[0021] 图8显示了使用16S核糖体RNA测序来分析微生物群落的试验。载体上的捕获寡 核苷酸被显示为对细菌16S核糖体RNA基因的两个恒定区域（8F和553R)具有选择性。这 两种引物可用来扩增大约1500个碱基对的基因的大约500个碱基对，而且包括VI、V2和V3 可变区域。通过延伸P5和P7扩增寡核苷酸而生成捕获寡核苷酸。然后使用捕获寡核苷酸 从样本中特异性地捕获16SrRNA基因的片段。然后延伸捕获寡核苷酸。通过使用扩增寡 核苷酸的固相扩增，各个延伸的捕获寡核苷酸可被转换成聚类。由于各个微生物具有特征 性的16S基因序列，基于被捕获和测序的不同16SRNA区域，对聚类的测序将提供关于微生 物群落成员的信息。
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