猪初生重性状相关plac1基因分子标记的克隆及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪初生重性状相关PLAC1 基因分子标记的克隆及应用。所述的分子标记从猪PLAC1基因中克隆得到，它包括猪PLAC1 基因编码区序列突变位点的检测方法与应用。
【背景技术】
[0002] 在养猪生产过程中，如何达到使母猪多产以及仔猪多活、快长从而提高生产性能、 降低生产成本成了养猪生产者关注的焦点，因此猪繁殖性状越来越受到人们的重视。
[0003] 猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，对猪出生后的生长速度及成活率具有重要 的作用。最近有很多文献报道了初生重对猪出生后生长速度的影响。Beaulieu等（Beaulieu AD等，Impactofpigletbirthweight,birthorderandlittersizeonsubsequent growthperformance,carcassquality,musclecompositionandeatingqualityof pork[J].JAnimSci. 2010)和Poore等（PooreK.R?等，Theeffectsofbirthweight andpostnatalgrowthpatternsonfatdepthandplasmaleptinconcentrationsin juvenileandadultpigs.J.Physiol. 2004)研宄发现，初生重较低的猪生长速度较慢，从 而使其进入市场的时间增加。另有研宄表明仔猪的初生重与育成率亦悉悉相关，初生重在 1.OKg以下时仔猪育成率随着初生重的增加而上升；初生重在1.OKg以上时仔猪育成率没 有明显的规律。初生重小于等于〇.5Kg时仔猪育成率仅为55. 56% (高建国.二花脸猪初生 重对出生后生长速度及育成率的影响[J].畜牧与兽医，1992,24(1) :26)，G〇ndret，F.L.等 (Gondret,F.L?等，Lowbirthweightisassociatedwithenlargedmusclefiberarea andimpairedmeattendesnessofthelongissimusmuscleinpigs.J.Anim.Sci. 2006) 和Wolter等（Wolter,B.F?等Theeffectofbirthweightandfeedingofsupplement milkreplacertopigletsduringlactationonpreweaningandpostweaninggrowth performanceandcarcasscharacteristic.J.Anim.Sci. 2002)研宄报道称，猪出生重与 出生后早期的生长速度相关，初生重小的胎儿初生重大的胎儿更虚弱，出生后需要更好地 环境条件来保证它的存活。
[0004] 胎盘是保证胎儿健康发育的重要场所，母体营养物质都要通过胎盘转运给胎儿。 猪胎盘是上皮绒毛膜型胎盘，胎儿侧的胎盘滋养层上皮不会嵌入母体子宫内膜基质内，而 是与子宫腔上皮相互粘附，并随着妊娠的进行形成裙皱（Miles,J.R.等Molecularcloning andcharacterisationofheparanasemRNAintheporcineplacentathroughout gestation.ReprodFertilDev. 2009)。胎盘裙皱的形成与发育可以大大增加母体与胎儿 营养物质交换的面积，即增加胎盘传输营养物质的效率（Vallet，J.等Developmentofthe pigplacenta.SocReprodFertilSuppl.2009 ;Linjun,H?等ExpressionofHeparanase IsAssociatedwithBreed-SpecificMorphologicalCharactersofPlacentalFolded BilayerBetweenYorkshireandMeishanPigs.BiolReprod. 2014)，而充足的营养物质 是保证胎儿健康发育的基础，营养物质供给不足会导致胎儿发育迟缓，并降低胎儿的初生 重，严重者甚至会导致胎儿死亡。因此胎盘褶皱的形成与发育对胎儿初生重具有重要影响。
[0005] PLAC1基因是在人、小鼠等哺乳动物胎盘中特异表达的基因，近期的研宄表明 PLAC1基因在妊娠过程中对胎盘滋养层上皮细胞的迀移、运动具有重要作用（Wen-Lin，C. 等Roleofplacenta-specificprotein1inthetrophoblastsinvasionand migration.Reproduction. 2014)，从而增大滋养层与母体子宫接触的面积，增加营养物质 的运输，有利于胎儿健康发育。另外有研宄发现，敲除PLAC1基因会导致胎盘肥大和胎儿宫 内发育迟缓（IUGR)，胎儿往往于妊娠后期或分娩后不久死亡，说明PLAC1基因是正常的胎 盘和胚胎发育所必需的（Jackman,S.M?等Placl(Placenta-specific1)IsEssentialfor NormalPlacentalandEmbryonicDevelopment.MolReprodDev. 2012)〇
[0006] 常规的育种技术对猪繁殖性状的改良进展缓慢，效果不明显，而且选择过程花费 时间长，耗费资金多，准确性有待提高（Linville，R.C.等Candidategeneanalysisfor lociaffectinglittersizeandovulationrateinswine.JAnimSci. 2001) 〇 分子 生物学技术的迅速发展使得猪的育种工作出现了新的曙光，目前，标记辅助选择（MAS)已 经成功应用到国内外的猪育种实践中，取得了巨大的经济效益，凭借这一技术手段，育种工 作者们发掘出了一大批与猪的初生重，生长速度，断奶重，产仔数等重要的繁殖性状有着显 著关联的分子标记。这为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大 的提尚。
[0007] 鉴于PLAC1基因在妊娠过程中对胎盘滋养层上皮细胞的迀移发挥重要作用，我们 认为它很可能在猪妊娠过程中对胎盘滋养层上皮细胞参与形成胎盘褶皱发挥着重要作用， 进而影响猪胎盘对营养物质的运输效率，从而对胎儿初生重具有重要影响。研宄基因突变 位点在群体中的多态性，并对其进行性状关联分析是研宄基因功能的一个非常有力的手 段，所以申请人对这个基因进行了多态性研宄和关联分析，以期能够发现它对猪繁殖性状 的影响。
【发明内容】
[0008] 发明的目的在于获得一种与猪初生重性状相关的分子标记，克隆PLAC1基因编码 区序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪初生重性状检测提供一种分子标 记和方法。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] 一种分子标记Hhal-RFLP在猪初生重性状关联分析中的应用，其步骤如下所述：
[0011] 1)用人PLAC1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性高的表达序 列标签（EST)，然后对EST进行拼接；提取猪妊娠95天胎盘组织总RNA并做cDNA第一链 反转录；设计引物对，该引物对的正向引物为5 ' -TCCTCTTCCGCCAATCCC-3 '，反向引物为 5' -GCCATCAGAAAITTAmTCTCTC-3'（见序列表SEQIDNO:5,6)，用RT-PCR方法扩增猪 PLAC1基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如SEQIDN0:2所示 的核苷酸序列（即cDNA序列）；
[0012] 2)根据SEQIDNO:2所示的核苷酸序列设计引物对，该引物对的核 苷酸序列如下所示：正向引物-CTGCTACGACGTGTTCACCTT-3 '，反向引物： 5 ' -AGCACAGGCTACCCATAAGAG-3 '(见序列表SEQIDNO:3,4)，扩增猪基因组DNA，将PCR 产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如下所述的核苷酸序列：
[0013] CTGCTACGACGTGTTCACCTTGTCTCAGGCCGGCCGAAGGCCCACCTGCCACTGTCCGCCCTATGTC TTCAGRGCAGGCGGGCGTACTTAGCCCTGCGGGCCCAGGCGGGGGCTCGGGAGGGCCACCTGTGCAGTAGTCTTC CTTCCTTTATACTTCTGACGATGAATCTCTTCTCTCGGGTGATCTGGCTGAGTCCAGGGATCCCCGGGCTTGGGG GGCTCCTGTACTTGCCCTTTCTGAAATTGGTATATACTAGGGACTAATCCGTGCTCTTGTGGCCCTCTTATGGGT AGCCTGTGCT
[0014] 上述序列中的R是C或T，导致Hhal-RFLP多态性；
[0015] 3)检测目的基因PLAClmRNA在猪胎盘的绒毛膜组织样中转录水平的表达，设计用 于检测目的基因PLAClmRNA表达水平的引物对以及作为内参基因GAPDH的引物对，其核苷 酸序列分别如下所示：
[0016] 扩增目的基因PLAC1的引物对：
[0017] 正向引物：5'GAAACCTCCACCAGACAGC3'，（见序列表SEQIDNO:7)
[0018] 反向引物：5'CCGTGACCATGAGCCAGT3'，（见序列表SEQIDNO:8)
[0019] 扩增内参基因GAPDH的引物对的DNA序列如下：
[0020] 正向引物：5'CACCAGGGCTGCTITTAACTCTG3'，（见序列表SEQIDNO:9)
[0021] 反向引物：5'GATGACAAGCTTCCCGITCTCC3' ；（见序列表SEQIDN0:10)
[0022] 4)PLAC1基因组织表达谱分析；
[0023] 5)定位PLAC1基因的mRNA在猪胎盘组织的表达位置；
[0024] 6)应用PCR-RFLP方法对序列表SEQIDNO: 1的第73位碱基进行检测，然后进行 基因型与猪初生重性状的关联分析。
[0025] SNP发现与检测方法建立：申请人设计了扩增包含该SNP的引物，经分析T/C位点 的突变可以采用Hhal进行酶切检测多态性。在扩增的302bp的片段上，存在一个Hhal的酶 切位点，电泳检测结果显示在PLAC1基因的T/C位点存在3中基因型，CC型（228bp、74bp)， TC型（302bp、228bp、74bp)，TT型（302bp)。酶切电泳结果证实了PLAC1基因CDS区该突变 位点的存在。
[0026] 同时通过荧光定量PCR检测了PLAC1基因在大白猪妊娠的第26天、50天和95天胎 盘组织样中转录水平的表达情况，结果表明（如图3所述），PLAC1基因在胎盘褶皱形成初 期（妊娠26天）表达量较低，随着妊娠的进行，表达量逐渐增高，在妊娠末期（妊娠95天） 仍具有较高的表达量。组织表达谱结果表明PLAC1基因只在猪胎盘组织中特异表达（如图 4所述）。另外通过原位杂交实验表明PLAC1基因mRNA只在胎盘滋养层上皮细胞中表达， 在胎盘基质细胞以及子宫中都不表达，其杂交模式在梅山与大白猪中没有显著区别（图5 所示）。由杂交信号的强弱程度可以看出，在妊娠26天，PLAC1基因mRNA的杂交信号较弱， 表明其表达量较低，而在妊娠50天和95天杂交信号都很强，表明其表达量在这两个时期都 很强，这与定量的结果相一致。PLAC1基因在猪胎盘组织中的时期特异性表达说明其在胎盘 发育及功能中有重要作用，很可能与促进猪胎盘褶皱的发育有关。
【附图说明】
[0027] 序列表SEQIDNO:1是本发明制备的分子标记的核苷酸序列，序列全长为302bp， 在该序列的第73bp处有一个C/T突变，该突变导致Hhal-RFLP多态性（其中序列表SEQID NO:1中73bp处的碱基已经由C突变为T)。
[0028] 序列表SEQIDNO:2是扩增的PLAC1基因的cDNA序列，序列全长为1106bp。
[0029] 序列表SEQIDNO:3-10是设计的引物序列（这些引物序列与说明书正文中的序 列说明是一致的）。
[0030] 图1 :是本发明PLAC1基因的分子标记的制备流程图。
[0031] 图2 :本发明中猪PLAC1基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段，即本发明制备的分 子标记（下划线部分为引物