混合模式抗体亲和分离基质和使用其的纯化方法及靶分子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于将靶分子特异性地纯化的亲和分离基质、特别是亲和配体和 其它配体可同时或连续地在单一基质上发挥作用的新型混合模式抗体亲和分离基质、使用 有该分离基质的纯化方法及靶分子。
【背景技术】
[0002] 亲和配体具有与特定的分子特异性结合的功能，将该配体在水不溶性载体上固定 化而成的亲和分离基质可以用于从含有生物体成分或重组体的微生物及哺乳类培养细胞 中有效地分离纯化有用物质。作为实际工业上利用的抗体亲和配体，例如可以举出：由蛋白 A或蛋白G、蛋白L等源自微生物或使它们重组表达而得到的功能性修饰体（类似物）构成 的肽性或蛋白质性配体、骆驼单链抗体（7夕久'--本鎖）或抗体的Fc受体等重组蛋白质 性配体、及噻唑衍生物等化学合成性配体，用于抗体医药品等的纯化。抗体医药品相对于化 学药品显示更低的毒性且显示更高的特异性，因此，作为理想的医药品，其需求不断增高。
[0003] 作为抗体医药品的主要成分的单克隆抗体主要使用哺乳类培养细胞等以重组蛋 白质的形式在培养液中表达，通过多级层析或膜工序高纯度纯化后进行制剂化。抗体医药 品为免疫球蛋白G及其类似物，一般而言除称为抗体的分子以外，还包含将免疫球蛋白分 子的恒定区域即Fc区域和其它的功能性蛋白质或肽融合而成的Fc融合蛋白质（含Fc分 子）。另外，这些抗体医药品还包含以微生物为宿主，在其培养上清液中分泌表达的医药品、 在菌体内或菌体外壁和菌体细胞膜之间蓄积表达、纯化、制剂化的医药品。
[0004] 该培养、纯化、制剂化的工序中所形成或残留的凝聚体（二聚体以上的多聚体）成 为副作用的主要原因，因此，降低其含量成为抗体医药品生产的重要课题。在此，所谓单体， 例如在抗体的情况下，将四聚体结构的抗体定义为1个分子单位，所述四聚体结构的抗体 具有下述构成：由作为恒定区域的Fc区域和可变区域构成的重链（H链）2分子以及由可变 区域构成的氢链（L链）2分子构成。该单位分子的多聚体形成凝聚体，成为抗体医药品的 副作用的主要原因。
[0005] 在培养、纯化、制剂化的工序中通过使用复杂的管理方法及添加剂来尝试对抑制 凝聚体的生成及其除去进行控制。特别是在纯化工序中，除抑制凝聚体的生成以外将其除 去也很重要。因此，在纯化工序中，要求开发一种简便且有效的凝聚体除去技术。
[0006] 抗体医药品的纯化工序中，利用特定单元操作的组合进行的纯化方法的模板化 (平台化）不断发展，在其初期纯化工序（回收工序）中，广泛利用将作为配体的蛋白A固 定化于水不溶性载体而成的抗体亲和分离基质（蛋白A载体）。一般而言使用在中性条件 下使抗体吸附于蛋白A载体，在酸性条件下使抗体溶出的方法，但在该溶出过程中暴露于 酸性条件下的抗体容易变性而形成凝聚体。一般而言，在蛋白A层析工序的后段，可通过离 子交换层析或疏水性相互作用层析等的组合除去凝聚体等杂质（非专利文献1、非专利文 献2、非专利文献3、专利文献5)。
[0007] 然而，在蛋白A层析工序后凝聚体含量较多时，在后段的杂质除去工序中导致目 标单体（monomer)的收率降低，因此，除尝试抑制蛋白A层析工序中的凝聚体形成以外，还 进一步尝试了除去该层析工序中的凝聚体。
[0008] 蛋白A层析工序通常进行酸性溶出，但溶出pH越低，形成凝聚体的风险越高，因 此，对蛋白A配体进行了施加蛋白质工程学修饰的尝试，使得需要pH3左右的较低pH溶出 的抗体也能够在PH3. 5?4左右溶出（专利文献1)。
[0009] 另外，在蛋白A层析工序的使用工序中，研宄了提高凝聚体的分离性的方法。即， 提出了一种溶出时的pH或离子强度的优化、以及划分溶出峰的前半部分和后半部分等的 方法。具体而言，是利用由于作为蛋白A载体的特性多聚体化而成的抗体分子以比未多聚 体化的抗体分子有更高的概率与蛋白A配体接触，因此，解离常数稍微变低，且基于微调疏 水性的分离机制的方法（专利文献2、专利文献3、专利文献4)。但是，这些方法难以进行严 密的控制，此外，分离性能低，无法用作一般的分离方法。
[0010] 如上所述，抗体亲和分离基质虽然对抗体显示较高的特异性且可达到高纯度化， 但即使严密地设置使用方法，单体和凝聚体的分离性能也较低，因此，作为凝聚体的除去工 序存在限制。
[0011] 现有技术文献
[0012] 专利文献
[0013] 专利文献1 :日本专利第4391830号
[0014] 专利文献 2 :W02008/085988
[0015] 专利文献3 :日本特表2010-507583
[0016] 专利文献 4 :W02010/019493
[0017] 专利文献 5 :W02010/141039
[0018] 非专利文献
[0019] 非专利文献 1 :Hober S?等著，" J. Chromatogr. B"，2007 年，848 卷，40-47 页
[0020] 非专利文献 2 :HLow D?等著，" J. Chromatogr. B"，2007 年，848 卷，48-63 页
[0021] 非专利文献 3 :Roque A.C. A?等著，" J. Chromatogr. A"，2007 年，1160 卷，44-55 页
【发明内容】
[0022] 发明所要解决的课题
[0023] 本发明的目的在于，提供一种新型分离材料和其分离方法，其中，在抗体或含Fc 靶分子纯化工序的第一层析工序中，可提高作为亲和纯化的主要目的的抗体自身的纯度， 同时可提高单体的选择分离特性，并且关于凝聚体除去，可降低对后段的杂质除去工序的 负荷。
[0024] 用于解决课题的技术方案
[0025] 本发明人鉴于上述课题进行了潜心研宄，结果发现，通过在非水溶载体上将抗体 亲和配体和阳离子交换基（阳离子交换配体）两者固定化，各自的配体协同地作用，可得到 兼具对抗体等含Fc靶分子的特异性吸附性能和优异的凝聚体除去性能的分离基质，完成 了本发明。
[0026] 即，本发明的混合模式抗体亲和分离基质为在同一分离基质中具有抗体亲和配体 和阳离子交换基的混合模式抗体亲和分离基质。
[0027] 另外，基于在靶分子的溶出pH条件下的阳离子交换基的动态结合容量优选为基 于在中性条件下的抗体亲和配体的动态结合容量的2倍以下。
[0028] 进而，优选对具有抗体亲和配体的分离基质附加阳离子交换基而成。
[0029] 另外，优选对具有阳离子交换基的分离基质附加抗体亲和配体而成。
[0030] 抗体亲和配体优选为选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白H、蛋白D、蛋白Arp、蛋白 FcyR、抗体结合性合成配体及它们的类似物中的至少1种，抗体亲和配体优选为选自蛋白 A、蛋白G、蛋白L及它们的类似物中的至少1种。
[0031] 另外，抗体亲和配体优选为选自蛋白A及它们的类似物中的至少1种。
[0032] 另外，阳离子交换基优选为含有选自羧基及硫酸基中的至少1种的配体。
[0033] 分离基质的水不溶性载体基材优选为选自碳水化合物及其衍生物、合成聚合物以 及玻璃中的至少1种，分离基质的基材的结构优选为多孔性珠、整体柱或膜。
[0034] 进而，本发明为一种靶分子的纯化方法，其使用有所述混合模式抗体亲和分离基 质。
[0035] 靶分子的溶出pH优选为6以下，靶分子的溶出pH进一步优选为2以上。
[0036] 靶分子优选为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子。
[0037] 另外，本发明为通过本发明的纯化方法纯化的靶分子。
[0038] 发明的效果
[0039] 根据本发明，在抗体等含Fc靶分子纯化工序的第一工序即亲和层析工序中，可提 高作为亲和纯化的主要目标的抗体自身的纯度，同时可提高单体的选择分离特性，并且可 降低对于后段的杂质除去工序的负荷。
【具体实施方式】
[0040] 本发明的混合模式抗体亲和分离基质的特征在于，抗体亲和配体和阳离子交换基 一起通过共价键固定化于分离基质（本说明书中，也称为水不溶性载体、载体）。
[0041 ] 本发明为在水不溶性载体中具有抗体亲和配体和阳离子交换基的混合模式抗体 亲和分离基质，因此，可使用预先将一方固定化的分离基质来制备。即，可以在具有抗体亲 和配体的分离基质中导入阳离子交换基，或在具有阳离子交换基的分离基质中将抗体亲和 配体固定化。或者，也可以在水不溶性载体中同时将两配体固定化。
[0042] 以下，对本发明中的抗体亲和配体、阳离子交换基、水不溶性载体、抗体亲和配体 及阳离子交换基向载体上的结合（固定化）等详细地进行说明。
[0043] 本发明中的所谓"抗体亲和配体"是指，抗原和抗体的结合所代表的基于特异性的 分子间亲和力从某种分子的集合中选择性地收集（结合）靶（目标）分子的物质。
[0044] 可用于本发明的抗体亲和配体只要具有可与作为靶分子的抗体或抗体的恒定区 域即含Fc分子特异性结合的特征，就没有特别限定，优选为肽性配体、蛋白质性配体或化 学合成性配体（合成化合物）。从相对于靶分子的特异性的观