用于提高饲料品质的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于提高饲料品质的方法和组合物
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求2012年6月26日提交的美国临时专利申请号61/664, 359的优先权， 所述申请的全部公开内容以引用方式并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及植物基因工程。更确切来说，本发明涉及用于改善饲料作物营养品质 的方法。
[0004] 序列表的并入
[0005] 将电子方式提交并且创建于2013年6月25日的文件名为"MONS336WO_ST25. txt" 的序列表文件以引用方式并入本文，其大小为18千字节（在Microsoft Windows?中计 算出文件大小）。
[0006] 发明背景
[0007] 本发明通过基因工程来提供方法和组合物，其中转基因苜蓿植物的酸性洗涤木 质素（ADL)水平降低，愈创木基木质素（G木质素）水平降低，中性洗涤纤维消化率水平 (NDFD)提高，并且植物活力与野生型相当，这使得农业适应性改善。饲料作物（包括豆科 植物、禾本科植物、玉米青IC料和芸苔属（brassica)等）在全世界种植以提供具有可消化 纤维的动物饲料。苜蓿和/或苜蓿干草是美国最重要的干草作物。虽然主要作为成捆干草 来饲喂，但是它也可以作为青贮料、碎干草、方粒饲料或颗粒饲料来饲喂。苜蓿（紫花苜蓿 (Medicago sativa))是饲料豆科植物，它占奶牛饲料的23%至34%。优质苜蓿干草是高度 可消化的并且提供较高的蛋白质、能量、维生素和矿物质。优质苜蓿也含较少纤维素和半纤 维素、较少木质素、较低纤维和较高相对饲用价值。苜蓿饲用价值常用NDFD来衡量。分析 苜蓿饲料的NDFD可提供奶牛能够从饲料获得能量的估计，并且有必要提高苜蓿中的纤维 消化率。例如，提高一个百分比单位的NDFD可使每天摄入的饲料干料提高0. 37镑，使4% 乳脂校正奶（FCM)产量提高0. 55镑/天。饲喂具有更高NDFD饲料的奶牛能够从饲料中获 得更多的总能量和营养价值。因此，在饮食中提供较少的谷物就能满足能量需求。饲料豆 科植物中较低的NDFD最常与饲料植物成熟度有关系，这伴随有木质素浓度的升高并且与 纤维素纤维升高有关。
[0008] 影响NDFD的因素包括酸性洗涤纤维（ADF)的量。ADF是指饲料的细胞壁部分，它 是饲料最难消化的部分，包括木质素、纤维素、二氧化硅和氮的不溶性形式。这些数值是特 别重要的，因为它们涉及家畜对饲料的消化率。具有较高ADF的饲料与具有较低ADF的饲 料相比消化能较低。因此，随着ADF水平升高，消化能水平降低。
【发明内容】
[0009] 本发明通过基因工程来提供一种方法和组合物，其中可以选择具有较高饲用价值 成分的转基因苜蓿植物，如与不包含本发明的DNA分子的非转基因对照植物相比，ADL和G 木质素的浓度降低，下茎部中的NDFD水平升高而活力至少相当，以及农业适应性。具有较 低木质素的苜蓿事件是通过使用RNAi构建体下调木质素生物合成酶紫花苜蓿（Medicago sativa) S-腺苷-L-甲硫氨酸：咖啡酰基-CoA 3-0-甲基转移酶（CCoAOMT)而产生的。所 有构建体都使用了美国专利申请公开2005/0176670中描述的稳定反义技术，以引用方式 并入本文中。选择较低木质素苜蓿的事件的方法是"木质素含量的降低，从而在10%开花 成熟阶段之前切割时整株植物消化率提高8-15%。所述方法从苜蓿植物种群中选择苜蓿植 物，其中所述苜蓿植物种群包含与SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2同源或互补的重组DNA分 子。所述方法包括分析苜蓿植物种群的下茎部并且选择满足以下条件的植物：与不包含这 些重组DNA分子的苜蓿植物相比时，（1)酸性洗涤木质素浓度降低，其中酸性洗涤木质素浓 度的降低介于12%和31%之间；(2)愈创木基木质素浓度降低，其中所述浓度降低约25% 或更高；（3)中性纤维消化率升高，其中NDFD值升高18%以上。
[0010] 在本发明的一个方面中，选择出的具有较高饲用价值成分的苜蓿植物具有大体上 等于不包含所述重组DNA分子的苜蓿植物的活力。
[0011] 在另一个方面中，本发明提供一种分析和选择已经用咖啡酰基CoA 3-0-甲基转 移酶（CCoAOMT)的抑制构建体（SEQ ID NO:7)转化的具有较高饲用价值成分的转基因苜蓿 植物的方法，它进一步包含维管-增强启动子（vascular-enhanced promoter)以调控与 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2同源或互补的重组DNA分子的转录。
[0012] 在又一个方面中，本发明提供通过本发明方法选择的苜蓿植物或所述植物的子 代，或来源于所述植物或子代植物的干草或青贮料，其中所述苜蓿植物或植物产品包含与 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2同源或互补的DNA分子，并且包含由下茎部中较低的ADL和G 木质素浓度、较高的NDFD水平带来的较高饲用价值成分。
[0013] 附图简述
[0014] 以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括来进一步说明本发明的某些方面。 通过参考这些附图中的一个或多个和以下对它们的相应描述并结合本文中提供的特定实 施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
[0015] 图1-用黑体例示并概述了与非转基因事件相比，具有抑制的咖啡酰基CoA 3-0-甲基转移酶（CCoAOMT)的良种转基因苜蓿事件的ADL浓度介于80%和91%之间；NDFD 值介于110%和125%之间；并且具有较低的G木质素值。
[0016] 图2-例示符合所要求的表现标准的KK179-2的良种事件和木质素降低苜蓿事件 (定义为"甜蜜点"），这些标准是以饲料消化率提高和营养品质提高的百分比ADL、NDFD和 活力的水平为基础。
[0017] 序列简述
[0018] SEQ ID N0:l-CCoA0MT 基因 1139987:1CR-紫花苜蓿 CC〇AOMT-1:1:1 的序列（有义 方向）。
[0019] SEQ ID NO:2-1150536: ICR-蒺藜苜蓿（Medicago truncatula)CCoA0MT-l: 1:2 的 序列（反义方向）。
[0020] SEQIDN0:3-介于有义臂与反义臂之间的RNA环的序列（374-530bp)。
[0021] SEQ ID N0:4-RNA 环的 5' 端的序列（7-73bp)。
[0022] SEQ ID NO:5-1141266:1 启动子（P)-Pv. Pal2-1:1:1 的序列。
[0023] SEQ ID N0:6-1141267:l 前导序列（L)-Pv.Pal2-l:l:l 的序列。
[0024] SEQ ID N0:7-pM0N100052CAS-Pv. Pal2//SUP-CCoAOMT//nos ;CAS-CaMV. 35S// npt2//nos 的序列。
[0025] 发明详述
[0026] 本发明提供一种方法，所述方法用于选择需要提高饲用价值的饲料作物。所述方 法的方面可应用于多种饲料作物，例如，包括但不限于瑞士三叶草（Alsike clover)、红豆 草（Sainfoin)、胡枝子（Lespedeza)、库拉三叶草（Kura clover)、拉地诺三叶草（Ladino clover)、红三叶草（Red clover)、白三叶草（white clover)、甜三叶草（sweet clover)、角 果百脉根（Birdsfoot trefoil)、鹰嘴紫云英（Cicer milkvetch)、小冠花（Crown Vetch)、 漢藜苜蓿（Medicago truncatula)和苜蓿（alfalfa)。
[0027] 根据本发明的方法可以包括但不限于，选择用重组DNA构建体转化的转基因饲料 作物苜蓿植物的方法，所述重组DNA构建体降低木质素生物合成途径中S-腺苷-L-甲硫氨 酸：咖啡酰基-CoA 3-0甲基转移酶（CCoAOMT或CC0MT)酶的表达或活性，所述方法使用与 不用所述重组DNA构建体转化的苜蓿植物相比酸性洗涤木质素（ADL)降低、愈创木基木质 素（G-木质素）降低、中性洗涤纤维消化率（NDFD)升高以及活力至少大体上相当或提高的 选择标准。本发明方法中的综合选择标准可选择具有较高饲用价值的苜蓿植物。本发明涉 及与选择并提高饲料作物营养相关的植物、植物部分、植物种子、植物细胞、农产品和方法。
[0028] 本发明还提供一种包含启动子分子的DNA分子，它在与对应于SEQ ID NO: 1(SEQ ID N0:7的核苷酸6583-6882)的DNA片段或其互补片段连接的苜蓿植物细胞的维管组织 中起作用。本发明还提供一种包含SEQ ID NO 1的DNA分子（连接于SEQ ID NO 3,连接 于SEQ ID NO 2)，这个组合包含在SEQ ID NO:7的构建体之内）。在本发明的另一个方面 中是包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2的苜蓿植物细胞、植物部分、干草或种子。
[0029] 本发明涉及一种具有改善的经济学重要特性、更高饲用价值的转基因植物。更具 体地讲，本发明涉及一种包含本发明核苷酸序列、本发明的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2并 且与非转基因对照植物相比饲用价值提高