一种鸡源性抗鸡新城疫病毒p蛋白的跨膜型胞内抗体、制备方法及其应用

文档序号:8294145阅读:761来源:国知局
一种鸡源性抗鸡新城疫病毒p蛋白的跨膜型胞内抗体、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域,具体的说,涉及一种鸡源性抗鸡新城疫病毒(NDV)P蛋白的跨膜型胞内抗体、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 新城疫病毒(NDV)属副粘病毒,其引起的新城疫(ND)是一种对世界养禽业危害极 为严重的传染病。NDV进入细胞后,首先转录产生mRNA,翻译出早期蛋白(NP,P蛋白),二 者与L蛋白共同组成病毒的核糖核蛋白复合体(RNP)之后,病毒mRNA才能翻译出其他晚期 蛋白(F蛋白、HN以及M蛋白等),进而组装成病毒粒子出芽。此外,P蛋白还能与未组装的 前体NP结合,形成P-NP复合物,该复合物既可激活病毒基因组复制,也可阻止前体NP与病 毒RNA非法组装形成核衣壳。由此可见,新城疫病毒进入宿主细胞后能否顺利复制增殖,其 中能否形成RNP是最为关键的。因此,深入研宄转录复合体(RNP)关键的P蛋白,无论是对 于病毒复制增殖机制研宄,还是新型抗病毒药物研发都是非常必要的。
[0003] 胞内抗体技术是一种全新的可阻断细胞内靶蛋白功能的技术,它通过特异性干扰 或阻断分布于该部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌过程,引起细胞的一系列生物 过程发生改变。根据胞内抗体的构建策略,将单链抗体克隆到真核表达载体,转染宿主细 胞,使表达的胞内抗体定位于亚细胞区室。
[0004] 然而,就国内外胞内抗体研宄现状来讲,无论是医学还是兽医学领域,均缺乏将 胞内抗体高效导入动物活体组织细胞的系统,严重制约了胞内抗体作为抗病毒药物的研 发。早先用于转运胞内抗体的载体绝大数为病毒载体,但其安全性和免疫原性却没有得到 很好解决;目前大多数研宄主要还是将胞内抗体编码基因重组到常规真核表达载体。由 于这些载体不具备感染动物组织细胞的能力,需要辅助接种手段导入细胞,如应用脂质体 (Lipofectamine)等将抗体编码质粒转染细胞,或者利用特殊的注射装置将表达抗体的质 粒导入细胞。这些手段都只是在实验室对培养细胞进行转染,对导入活体动物组织细胞则 难以凑效。可见,选择合适有效的导入系统是研制高效抗病毒胞内抗体的技术关键之一。
[0005] 近年来医学领域报道的一种新型跨膜抗体(Transbody),出现了解决问题的曙光。 跨膜抗体就是将常规单链抗体与穿膜肽穿膜肽进行融合表达,赋予单链抗体穿越细胞膜、 直接到达细胞内的一种能力。穿膜肽是一种能够携带外源物质进入细胞的小分子肽类物 质。目前已报告的穿膜肽有141\¥?22、1^、?印-1等很多种,新近发现的一种新型跨膜转导 肽(CTP),不仅具有非常好的穿透细胞膜的特性,同时具有显著胞浆定位特点。NDV的P蛋 白正好分布于胞浆,

【发明内容】

[0006] 鉴于NDV转录复合体蛋白(RNPs)在病毒复制增殖过程中所处的关键环节,本发明 构建了抗NDV转录复合体蛋白P蛋白的跨模型胞内抗体,利用胞内抗体对RNPs进行抑制, 可获得最大程度的抗病毒效果,为新城疫的预防和控制提供一种新的方法。
[0007] 本发明中用早先筛选到的抗NDV的P蛋白的单链抗体(scFvZLl)编码基 因C端连接跨膜转导肽(CTP)基因,克隆到原核表达载体(pET28a(+)),构建成重组质 粒pET28a-SCFvZLI-CTP并在大肠杆菌进行诱导表达,得到跨模型细胞内抗体表达质粒 pET28a-scFvZLl-CTP,其原核表达产物即为本发明的跨膜型胞内抗体Trans-ZLl-CTP。其 CTP可介导单链抗体蛋白跨越细胞膜进入细胞内,在胞浆中定位,并与细胞内NDV的P蛋白 特异性结合,阻止RNPs的形成,从而发挥其细胞内抗病功能,进而用于鸡新城疫治疗。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的。
[0009] -种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的跨膜型胞内抗体的制备方法,其通过扩增克 隆筛选鉴定的鸡源抗NDV的P蛋白单链抗体scFvZLl编码基因与跨膜肽CTP基因融合得 到的scFvZLl-CTP编码基因到原核表达载体pET28a(+)中,构建成鸡源性抗NDV的P蛋白 的跨模型细胞内抗体表达质粒pET28a-scFVZLl-CTP,其原核表达产物是跨模型胞内抗体 Trans-ZLl-CTP。具体步骤如下:
[0010] (I)PCR扩增目的基因
[0011] 取冷冻保存的抗体ZLl工程菌,分区划线LB平板,从LB平板挑取单克隆后摇菌, 按常规方法提取质粒,取Iy1作为模板,利用特异性引物PCR扩增目的基因scFvZLl-CTP, 所述特异性引物中所述特异性引物中融合加入33个碱基的CTP;经检测无误后,采用 AxyGEN胶回收试剂盒回收扩增的目的片段scfvZLl-CTP;
[0012] (2)目的片段scFvZLl-CTP和载体pET28a⑴载体黏性末端的制备
[0013] 将上述回收的目的片段scFvZLl-CTP和原核表达载体pET28a(+)用EcoRI和Nco I双酶切,然后经琼脂糖凝胶电泳验证,对酶切产物目的条带采用AxyGEN胶回收试剂盒纯 化回收;
[0014] (3)目的基因与表达载体的连接
[0015] 将上述回收的目的片段scFvZLl-CTP和原核表达载体pET28a(+)载体用T4DNA连 接酶进行连接,得到重组质粒pET28a-scFvZLl-CTP;
[0016] (4)pET28a-scFvZLl_CTP重组质粒诱导表达和纯化
[0017] 先将重组质粒pET28a-scFvZLl-CTP转化至Transl-Blue感受态细胞中,重组菌经 ImM的IPTG诱导表达后,得到跨膜型细胞内抗体表达质粒pET28a-scFVZLl-CTP,收集菌体, 再用冰浴PBS悬浮细菌,加入2XSDS-PAGE上样缓冲液,煮沸,然后放入冰水混合物冷冻、离 心收集沉淀;最后采用Ni-NTA-琼脂糖纯化柱纯化沉淀,得到纯化后的融合蛋白,即跨膜胞 内抗体Trans-ZLl-CTP。
[0018] 本发明中,步骤(1)中,扩增scFvZLl-CTP的特异性引物如下:
[0019] 上游引物:5' -CGGAATTCGCCGTGACGTTGGAC-3' ;
[0020] 下游引物:
[0021] 5,-GAGTCATTCTGCGGCCGCACGGCGACGCTGGCGACGTTTCTTACGACCGTATAGG ACGGTCAGGGTTGTCCC-3' ;
[0022] 其中:上游引物包含一个EcoRI酶切位点,下游引物包含一个NotI酶切位点,下 划线为编码CTP的33个碱基的序列。
[0023] 本发明还提供上述制备方法获得的鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的跨膜型胞内 抗体。
[0024] 本发明进一步提供一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的跨膜型胞内抗体于制备 新城疫的预防和/或治疗药物中的应用。
[0025] 本发明的有益效果在于:
[0026] 1、本发明中的跨模型胞内抗体是一种能直接穿越细胞膜,在细胞浆分布的抗NDV 的P蛋白的基因工程胞内抗体,该胞内抗体对宿主细胞没有毒性。
[0027] 2、本发明中将跨模型胞内抗体转染BHK21细胞,经Westernblot鉴定,证实跨模 型胞内抗体能有效跨越细胞膜进入细胞,在细胞浆分布,表现了显著的细胞内抗病毒活性, 能够用于鸡新城疫的治疗。
【附图说明】
[0028] 图1为scFv-ZLl-CTP电泳图。M标准分子量;1,2scFvZLl-CTP基因片段。
[0029] 图2为构建的pET28a-scFvZLl-CTP原核表达质粒图。
[0030] 图3为构建的融合scFv-CTP基因及表达氨基酸序列图。
[0031] 图4为SDS-PAGE检测pET28a-scFvZLl-CTP的表达图;1.蛋白质分子量标准; 2pET28a-scFvZLl-CTP阳性菌未诱导表达产物;3.pET28a-scFvZLl-CTP阳性菌经诱导表达 产物(scFvZLl-CTP)。
[0032] 图5为重组质粒pET28a-scFvZLl-CTP阳性菌表达产物(scFvZLl-CTP)纯化图; M.蛋白质分子量标准;1.表达菌破碎后上清;2.表达菌超声破碎后沉淀;3.对照。
[0033] 图6为WesternBlot分析Trans-ZLl-CTP融合蛋白进入细胞的最佳溶度 (beta-actin作为内参照)图示;1为DMEM,2-5分别为Trans-ZLl-CTP融合蛋白lyM, 2yM,3yM,4yM。可见第4道,Trans-ZLl-CTP融合蛋白进入细胞的最佳浓度为3yM。
[0034] 图7为MTT实验验证穿膜抗体对细胞的影响图;由左至右分别为DMEM(control), Trans-ZLl-CTP和scFvZL2(本发明以外的胞内抗体)。
[0035] 图8为TCID50实验检测胞内抗体对细胞的保护效果图。
【具体实施方式】:
[0036] 实施例1抗鸡新城疫病毒P蛋白的重组质粒pET28a-scFVZLl-CTP的构建
[0037]UPCR引物的设计基因序列扩增
[0038] 根据早先筛选获得的单链抗体序列scFvZLl(【申请号】2013102369637),设计二条 引物(P1,P2),其中Pl为重链可变区VH的5'引物,P2为轻链可变区VL的3'引物;在VH 的5'端引入内切酶EcoRI;而在VL的3'端融合加入33个碱基的CTP,在CTP端
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