一种杂合抗菌肽及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是基因工程技术领域，尤其涉及的是一种杂合抗菌肽及其编码基因 和应用。
【背景技术】
[0002] 目前，由于抗生素在临床中被大量使用，产生严重的耐药性问题。人类急需新型的 药物来代替抗生素，抗菌肽是一类小分子两亲性多肽，长度一般小于50个氨基酸。来源于 自然界中的各种细菌、植物和动物，分布广泛。因其抗菌机理独特，不易产生耐药性，并且有 水溶性好，热稳定性强，抗菌谱广，有望成为传统抗生素的替代品。随着对抗菌肽作用机制、 分子结构与功能关系等研宄的深入开展，人们在发掘新抗菌肽的同时，更注重寻找高效、广 谱、低毒、肽链较短的抗菌肽，而杂合肽就是一类这样的新型抗菌肽。
[0003] 抗菌肽LfcinB是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶作用后从N-末端释放的大小为25个残 基组成的结构域，是近年来发现的一种新型抗菌肽，具备抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和调节机 体的免疫和提高肠道对铁离子的吸收等作用，其抗菌活性比乳铁蛋白高400多倍，具有重 要的应用价值。LfcinB来源于动物本身，氨基酸序列为FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF，其中 不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全的产品，LfcinB具有营养生理调节作用， 提高幼龄动物的免疫机能，改善动物肠道微生态环境，促进动物健康的作用，它不会使细菌 产生抗药性，也不会残留于畜产品中，具有替代抗生素的巨大潜能。其具有传统抗生素没有 的作用效果。LfcinB的抗菌作用机理研宄显示，位于LfcinB-侧的2个疏水性Trp残基和 另一侧的3个带正电荷的Arg残基可与细菌或病毒细胞膜结合，其中Trp易起着膜定位器 的作用，带正电荷的Arg残基与膜上磷脂基团的阴离子相互作用，接着与膜上的脂多糖相 互作用，然后通过膜定位器Trp使肽分子的疏水性a-螺旋插入膜内，聚合形成孔道，导致 内容物外泻，细菌或病毒死亡。利用核磁共振（NMR)的X衍射分析发现，LfcinB的空间构 象为扭曲的反向平行的0 -折叠，对照LF(乳铁蛋白）的X衍射分析，LF的结构为a-螺 旋结构：由此可以解释正是由a-螺旋结构向0-折叠的转化，导致LfcinB的抑菌活性强 于LF，因为0 -折叠构象更易于贴近细菌的表面，从而有了更多与细菌接触的机会。
[0004] 颗粒裂解肽（GranuIysin)是阳离子抗菌肽的一种，来自细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)和自然杀伤细胞（NK)，是能插入细胞膜中的SAPLIP家族的主要成员。研宄表明，颗 粒裂解肽能分裂类脂膜，诱导哺乳动物细胞的编程性细胞死亡，对革兰氏染色阳性和革兰 氏染色阴性菌、真菌、原虫、肿瘤细胞都有很强的溶解活性，与一系列人类感染，肿瘤和免疫 介导的疾病的诊断与治疗有着紧密的联系。颗粒裂解肽的空间结构主要由五个a-螺旋构 成，命名为H1-H5结构域，各结构域之间通过loop环连接。对各结构域抗菌活性研宄发现， 具有H2结构域的部位与其他结构域相比活性最强。G13结构域是颗粒裂解肽中含H2的肽 段片段，含19个氨基酸残基、a-螺旋结构及Ioop结构，该肽段有5个Arg残基，净电荷 为+5,可以同带负电的细菌细胞膜成分相互作用，造成宿主菌细胞膜破裂，可抑制细菌、真 菌的活性，但对动物细胞和脂质体没有影响，抗菌肽G13具有的较多的正电荷与稳定的两 性a-螺旋结合有助于提尚杀菌活性。
[0005] 抗菌肽的表达体系目前有以下几个来源：天然抗菌肽虽然来源广泛，但是在生物 体内产量小，难于分离纯化，成本高。化学合成抗菌肽虽然周期短、工程量小、能随意组合氨 基酸残基，但存在消旋化问题，并且生产成本昂贵。基因工程技术主要通过原核表达和真核 表达途径，具有操作简单，易于分离和纯化，且生产成本低等特点，使其具有规模化、产业化 生产的潜力，成为近些年来的研宄热点。
[0006] 原核表达体系以大肠杆菌表达体系为主，是目前掌握最为成熟的表达系统，其优 点是生长周期短，表达产量较高，成本相对低廉。但表达抗菌肽具有以下缺点：原核表达需 破碎细胞释放抗菌肽，增加了生产成本和分离纯化的难度；其持续表达可能会对宿主细胞 产生毒害作用，添加融合头融合表达虽然能够减少毒性，但需切割融合头，步骤繁琐；原核 表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
[0007] 酵母表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又有真核生物对蛋白质进 行翻译后修饰的优点。酿酒酵母遗传背景清楚，易操作；酿酒酵母与日常生活密切，安全，无 毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化； 工艺简单成本较低等特点。酿酒酵母做为宿主表达抗菌肽可以把培养基中菌体与诱导表达 的上清，直接作为双功能饲料添加剂，既可以补充饲料蛋白，又可以替代饲料中添加的传统 抗生素，是一种新的绿色环保饲料添加剂，具有重要应用价值。目前关于酿酒酵母分泌表达 抗菌肽的报道很少，本方法对抗菌肽的真核表达研宄具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种杂合抗菌肽及其编码基因和 应用，以提供一种抗菌活性强、产量大、成本低、易于分离和纯化的新型抗菌肽及其真核表 达系统。
[0009] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0010] 本发明提供了一种杂合抗菌肽，所述杂合抗菌肽包括串联连接的抗菌肽LfCinB 和抗菌肽G13,所述抗菌肽LfcinB具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，所述抗菌肽G13 具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
[0011] 本发明还提供了上述杂合抗菌肽的编码基因，所述编码基因包括抗菌肽LfcinB基因和抗菌肽G13基因。
[0012] 所述抗菌肽LfcinB基因具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，所述抗菌肽G13 基因具有如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
[0013] 本发明还提供了一种上述杂合抗菌肽的编码基因的重组质粒，所述重组质粒为含 有杂合抗菌肽的编码基因的酿酒酵母蛋白表达载体。
[0014] 所述酿酒酵母蛋白表达载体为pYES2/CT/a-factor载体。
[0015] 本发明还提供了一种含有上述重组质粒的遗传工程菌，所述遗传工程菌为含有所 述重组质粒的酿酒酵母细胞。
[0016] 所述酿酒酵母细胞为酿酒酵母INVSCl细胞。
[0017] 本发明还提供了一种上述遗传工程菌在制备抗菌药物中的应用。
[0018] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种杂合抗菌肽及其编码基因 和应用，该杂合抗菌肽包含抗菌肽LfcinB和抗菌肽G13两种具有不同结构特点的抗菌肽， 由于抗菌肽G13具有的较多的正电荷与稳定的两性a-螺旋，能够提高抗菌肽的整体活性， 同时结合抗菌肽LfcinB的0 -折叠，使该杂合抗菌肽更易于贴近细菌的表面，从而有了更 多与细菌接触的机会，两者结合，相互促进，大大提高了抗菌肽的杀菌活性；本发明还提供 了该杂合抗菌肽的真核表达系统，即将该杂合抗菌肽的编码基因导入酿酒酵母蛋白表达系 统中，具有表达产量较高、易于操作、安全无毒素、易于纯化、工艺简单、成本低廉的优点，具 有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0019] 图1为杂合抗菌肽的编码基因的琼脂糖凝胶电泳图；
[0020] 图2为重组质粒pYES2-a-LG的结构示意图；
[0021] 图3为遗传工程菌诱导表达的杂合抗菌肽的Tricine-SDS-PAGE电泳图；
[0022] 图4为杂合抗菌肽对大肠杆菌和枯草杆菌抑菌活性检测图。
【具体实施方式】
[0023] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0024] 实施例1
[0025] 本实施例的杂合抗菌肽的构建方法，包括以下步骤：
[0026] 1、抗菌肽LfcinB基因的获得
[0027] 抗菌肽LfcinB的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示，依照酿酒酵母密码子偏好性对 其编码的核苷酸序列进行优化，获得如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，人工合成该核苷酸 序列；
[0028] 设计引物，并以上述人工合成的核苷酸序列为模板，进行PCR扩增，其中，在上游 引物LfcinB-Fl中引入XhoI酶切位点，下游引物不含酶切位点，扩增后为平末端，所述引 物序列为：
[0029] LfcinB-Fl:5' -CCGCTCGAGAAAAGATTTAAATGTAG-3'
[0030] LfcinB-Rl:5, -GGTAGATAATGAACACAATCTTCTCGAAAA-3'
[0031] PCR扩增的反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸 lmin，30个循环后，再在72°C下继续延伸lOmin，扩增的产物经纯化回收后，置于-20°C下保 存备用。
[0032] 2、抗菌肽G13基因的获得
[0033] 抗菌肽G13为颗粒裂解肽的G13结构域的肽段片段，其氨基酸残基序列如SEQID NO:2所示，依照酿酒酵母密码子偏好性对其编码的核苷酸序列进行优化，获得如SEQID NO:4所示的核苷酸序列，人工合成该核苷酸序列；
[0034] 设计引物，并以上述人工合成的核苷酸序列为模板，进行PCR扩增，其中，在下游 引物G13-R2中引入EcoRI酶切位点，上游引物不含酶切位点，扩增后为平末端，所述引物 序列为：
[0035]G13-F2 :5' -CAAAGATCTGTTTCTAATGCTGCTACTAGAGTTTG-3'
[0036]G13-R2 :5' -GGAATTCTTACCATCTAGATCT