一种猪流行性腹泻病毒的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物病毒领域，更具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒的培养方 法。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻病毒严重影响了我国的养猪业，其感染性强、危害性大，是影响全球 养猪业的最重要病毒之一，哺乳仔猪感染后死亡率可达100 %，母猪常以带毒而不表现症状 形式出现。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属的1群，传染性胃肠炎，猫冠状病 毒、犬冠状病毒与其属于同一冠状病毒属（Utiger等，1995a)。猪流行性腹泻病毒最初在20 世纪70年代被发现，首次发现的病毒经分离纯化及传代后的病毒被命名为CV777,至今很 多疫苗生产单位仍然在使用该毒株作为疫苗毒株使用。最近几年在临床上爆发了严重的哺 乳仔猪腹泻，且死亡率极高，因此各研宄机构都在对引起该疾病的病原进行分析。调查结果 显示，引起哺乳仔猪腹泻并死亡的主要病原为猪流行性腹泻病毒，通过对现流行毒株的基 因分析，发现流行毒株与二十世纪70年代分离到的CV777毒力基因发生了较大的改变，所 以这也许是用含有原始毒株的疫苗免疫失败的原因之一。
[0003] 目前，各个研宄机构对临床分离的猪流行性腹泻病毒进行了体外细胞感染，试图 通过体外培养来使该病毒增殖以期用于目前的猪流行性腹泻的防控。国内外有多篇文献报 道指出，临床分离到的猪流行性腹泻病毒可以用多种细胞进行体外感染，如VERO细胞、BHK 细胞等，但临床新分离的猪流行性腹泻病毒野毒株很难培养，并且培养后基本测不到半数 组织细胞感染量（TCID50)，这给该病毒扩大生产及病毒量确定造成了巨大难题，所以如何 提高病毒对细胞的浸染效率使之适应体外规模化培养是该病毒体外培养的难点所在。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种猪流行性腹 泻病毒的培养方法。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明提供一种猪流行性腹泻病毒 的培养方法，包括以下步骤：
[0006] (I)DMEM培养基的配制：将13. 4克DMEM干粉溶于去一升的离子水中，搅拌至完全 溶解后，调节PH值至6. 8-7. 8,并用彡0. 22 μ m的无菌滤膜进行除菌过滤，置于彡4°C的冰 箱待用；
[0007] (2)在上述配制好的DMEM培养基中加入占 DMEM培养基体积1-8%的胎牛血清，并 将该DMEM培养基置于培养容器内进行单层细胞的培养；
[0008] (3)将形成有单层细胞的培养容器内的DMEM培养基弃去，并用洗液洗涤2-3次；
[0009] (4)弃去洗液，向形成有单层细胞的培养容器内加入猪胰蛋白酶、细胞亲和剂和步 骤（1)中的DMEM培养基，其中猪胰蛋白酶的用量为DMEM培养基体积用量的0. 1-0.5%，细 胞亲和剂用量为DMEM培养基体积用量的0. 01-1 % ;
[0010] (5)将步骤（4)中加入猪胰蛋白酶和细胞亲和剂的DMEM培养基放置细胞培养箱中 静置培养1分钟-30分钟，静置培养后取出并迅速接种猪流行性腹泻病毒，混合均匀后放置 于细胞培养箱进行培养，收集猪流行性腹泻病毒液。
[0011] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，步骤（2)中所述的单层细胞 为Vero单层细胞、293单层细胞、ST单层细胞、BHK单层细胞中的任意一种。
[0012] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，步骤（3)中所述的洗液为无 菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养液中的任意一种。
[0013] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，在步骤（4)中所述的细胞亲 和剂由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
[0014] 苹果酸 Q. 1-1%; 草酸 0.12-1.2%; 山梨酸 0.1-1%; 磷酸 0. 01-0. 1%; 无机盆 0. 36-3%; 去离子水 余量。
[0015] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，在步骤（4)中所述的细胞亲 和剂由原料混合液制成，所述原料混合液由按照质量百分数计的如下组分：
[0016] 苹杲酸 0. 3-0. 8%; 草酸 0.2-0.8%; 山梨酸 0.5-0. 7%; 磷酸 0. 04-0. 06%; 无机It 0. 5-2. 5%; 去离子水 余量。
[0017] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述无机盐由氯化钠、氯化钾 和磷酸二氢钠组成，所述氯化钠占细胞亲和剂总重的0. 1-1. 2% ;所述氯化钾占细胞亲和剂 总重的0. 1-1% ;所述磷酸二氢钠占细胞亲和剂总重的0. 16-0. 8%。
[0018] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述氯化钠占细胞亲和剂总 重的0. 2-0. 8% ;所述氯化钾占细胞亲和剂总重的0. 3-0. 5% ;所述磷酸二氢钠占细胞亲和 剂总重的0. 25-0. 5%。
[0019] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒的培养方法，其中，所述细胞亲和剂的制备方法 如下，按照上述质量百分比称取适量的苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二 氢钠和去离子水，将上述各组分溶于去离子水中，过滤即得。
[0020] 本培养方法主要是在培养过程中通过改变病毒与细胞间的微关系，增加病毒与细 胞间亲和度，使病毒更容易感染细胞。此方法的优点在于可以使猪流行性腹泻病毒更加快 速的感染非易感细胞，减少了非易感细胞对于猪流行性腹泻病毒的排斥，从而可以使猪流 行性腹泻病毒比通用方法更加快速的在体外培养，根据病毒在细胞产生的病变确定病毒的 TCID50,为该病毒的疫苗研发奠定基础。
【附图说明】
[0021] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0022] 图1为添加本发明实施例1的细胞亲和剂后，原代病毒盲传5-8代次后细胞的病 变情况的倒置显微镜图；
[0023] 图2为添加本发明实施例2的细胞亲和剂后，原代病毒盲传 5-8代次后细胞的病 变情况的倒置显微镜图；
[0024] 图3为添加本发明实施例3的细胞亲和剂后，原代病毒盲传 5-8代次后细胞的病 变情况的倒置显微镜图；
[0025] 图4为原代病毒盲传5-8代次后细胞的病变情况的倒置显微镜图（未添加细胞亲 和剂）。
【具体实施方式】
[0026] 下面，结合附图以及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0027] 提供一种猪流行性腹泻病毒的培养方法，包括以下步骤：
[0028] (I)DMEM培养基的配制：将13. 4克DMEM干粉溶于去一升的离子水中，搅拌至完全 溶解后，调节PH值至6. 8-7. 8,并用彡0. 22 μ m的无菌滤膜进行除菌过滤，置于彡4°C的冰 箱待用；
[0029] (2)在上述配制好的DMEM培养基中加入占 DMEM培养基体积1-8%的胎牛血清，并 将该DMEM培养基置于培养容器内进行单层细胞的培养；所述的单层细胞为Vero单层细胞、