除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，特别是涉及一种对2, 4-D 具有抗性的蛋白质、其编码基因及用途。
【背景技术】
[0002] 杂草可以迅速耗尽土壤中作物和其它目的植物所需要的有价值的养分。目前有许 多类型的除草剂用于控制杂草，一种特别流行的除草剂是草甘膦。已经开发了对草甘膦具 有抗性的作物，如玉米、大豆、棉花、甜菜、小麦和水稻等。因此可以对种植草甘膦抗性作物 的田地喷洒草甘膦以控制杂草而不显著损害作物。
[0003] 草甘膦已经在全球广泛使用超过20年，由此导致对草甘膦和草甘膦耐性作物技 术的过度依赖，并在野生杂草物种中对草甘膦天然更具耐受性或已经发展出抗草甘膦活性 的植物施加了高选择压。已报道有少数杂草已发展出对草甘膦的抗性，包括阔叶杂草和禾 本科杂草，如瑞士黑麦草、多花黑麦草、牛筋草、豚草、小飞蓬、野塘蒿和长叶车前。此外，在 广泛使用草甘膦耐性作物之前并不是农业问题的杂草也逐渐盛行，并且难于用草甘膦耐性 作物控制，这些杂草主要与（但不仅与）难于控制的阔叶杂草一起出现，如苋属、藜属、蒲公 英属和鸭跖草科物种。
[0004] 在草甘膦抗性杂草或难于控制的杂草物种的地区，种植者可以通过罐混或换用能 控制遗漏杂草的其它除草剂来弥补草甘膦的弱点。在多数情况下控制阔叶杂草的一种流行 且有效的罐混伴侣为2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D)。2, 4-D已经在农业和非作物条件下用 于广谱阔叶杂草控制超过65年，仍是全球最广泛使用的除草剂之一。对进一步使用2, 4-D 的限制在于它在双子叶植物（如大豆或棉花）中的选择性非常低，因此2, 4-D-般不用于 (且一般不靠近）敏感性双子叶作物。此外，2, 4-D在禾本科作物中的用途在某种程度上受 限于可能出现的作物损伤的性质。2, 4-D和草甘膦的组合已经用于在种植免耕大豆和棉花 之前提供更强的灭生处理，然而，由于这些双子叶物种对2, 4-D的敏感性，这些灭生处理必 须在种植前14-30天进行。
[0005] 和MCPA、2-甲-4-氯丙酸和2, 4-D丙酸一样，2, 4-D是苯氧酸类除草剂。2, 4-D用 于在许多单子叶作物（如玉米、小麦和水稻）中选择性控制阔叶杂草而不严重损伤目的作 物。2, 4-D是合成的植物生长素衍生物，其作用为使正常的细胞激素内稳态失调，并阻碍平 衡的受控生长。
[0006] 2, 4-D对某些植物具有不同水平的选择性（如双子叶植物比禾本科植物更敏感）。 不同植物对2, 4-D的不同代谢是不同水平选择性的一种解释。通常植物缓慢代谢2, 4-D，因 此靶位点的不同活性更可能解释植物对2, 4-D不同的应答。2, 4-D的植物代谢一般通过两 步代谢实现，一般是羟基化后接着与氨基酸或葡萄糖缀合。
[0007] 随着时间的发展，微生物种群已经发展出降解此特定外来物的有效的替代途径， 所述途径引起2, 4-D的完全矿化。对微生物连续应用除草剂可用来选择能利用除草剂作为 碳源用于生长（从而使其在土壤中具有竞争优势）的微生物。因为这个原因，目前将2, 4-D 配制为具有相对短的土壤半衰期，并且对其后的作物没有遇到明显的遗留效应。这促进了 2,4-D的除草剂应用。
[0008] 已经广泛研宄了其降解2, 4-D能力的一种生物是真养雷氏菌（Ralstonia eutropha)。编码矿化途径中的第一个酶促步骤的基因为tfdA。TfdA通过α酮戊二酸依 赖性双加氧酶反应催化2, 4-D酸转化成二氯苯酚（DCP)。DCP与2, 4-D相比几乎不具有除 草剂活性。TfdA在转基因植物中用于向通常对2, 4-D敏感的双子叶植物（如棉花和烟草） 中输入2, 4-D抗性。
[0009] 已在环境中鉴定了大量编码能降解2, 4-D的蛋白质的tfdA型基因。许多同系物与 tfdA类似（氨基酸同一性>85%)并具有与tfdA相似的酶活性。然而，不是所有具有TauD 等结构域的蛋白质都具有2, 4-D降解功能，并且有大量同系物与tfdA具有显著更低的同一 性（25-50%)，但却具有与α酮戊二酸依赖性双加氧酶Fe+ 2双加氧酶相关的特征残基。因 此这些不同的双加氧酶的底物特异性是什么并不明确。与tfdA具有低同源性（氨基酸同 一性28% )的独特实例是来自Sphingobium herbicidovorans的rdpA。已经显示此酶催 化（R)-2, 4-D丙酸（和其它（R)-苯氧丙酸）以及2, 4-D(苯氧乙酸）矿化的第一步。
[0010] 随着草甘膦抗性杂草的出现和2, 4-D除草剂的扩大应用，需要对2, 4-D敏感的目 的植物中输入2, 4-D抗性。目前未发现24DT22除草剂抗性蛋白在植物中的表达水平和对 除草剂的耐受性报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种除草剂抗性蛋白质、其编码基因及用途，本发明旨在提 供一种新的24DT22基因，所述24DT22蛋白在植物中对除草剂具有较高的耐受性。
[0012] 为实现上述目的，本发明提供了一种除草剂抗性蛋白质，包括：
[0013] (a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0014] (b)在（a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且 具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由（a)衍生的蛋白质。
[0015] 为实现上述目的，本发明提供了一种除草剂抗性基因，包括：
[0016] (a)编码所述除草剂抗性蛋白质的核苷酸序列；或
[0017] (b)在严格条件下与（a)限定的核苷酸序列杂交且编码具有芳氧基链烷酸酯双加 氧酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或
[0018] (c)具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0019] 所述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠）、0. 5% SDS (十二烷基硫酸钠）溶液中， 在65°C下杂交，然后用2XSSC、0. 1% SDS和1XSSC、0. 1% SDS各洗膜1次。
[0020] 为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控 下的所述除草剂抗性基因。
[0021] 为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒的 重组载体。
[0022] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生除草剂抗性蛋白质的方法，包括：
[0023] 获得包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒的转基因宿主生物的细胞；
[0024] 在允许产生除草剂抗性蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；
[0025] 回收所述除草剂抗性蛋白质。
[0026] 进一步地，所述转基因宿主生物包括植物、动物、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻 类。
[0027] 优选地，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
[0028] 为实现上述目的，本发明还提供了一种增加耐受除草剂范围的方法，包括：将所述 除草剂抗性蛋白质或所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质在植物中与至少一种不同于所 述除草剂抗性蛋白质或所述表达盒编码的除草剂抗性蛋白质的第二种核苷酸一起表达。
[0029] 进一步地，所述第二种核苷酸编码草甘膦抗性蛋白质、草铵膦抗性蛋白质、4-羟苯 基丙酮酸双加氧酶、乙酰乳酸合酶、细胞色素类蛋白质或原卟啉原氧化酶。
[0030] 在本发明中，24DT22除草剂抗性蛋白质在一种转基因植物中的表达可以伴随着一 个或多个草甘膦抗性蛋白质和/或草铵膦抗性蛋白质的表达。这种超过一种的除草剂抗性 蛋白质在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因 来实现。另外，一种植物（第1亲本）可以通过遗传工程操作表达24DT22除草剂抗性蛋白 质，第二种植物（第2亲本）可以通过遗传工程操作表达草甘膦抗性蛋白质和/或草铵膦 抗性蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因 的后代植物。
[0031] 为实现上述目的，本发明还提供了一种选择转化的植物细胞的方法，包括：用所述 除草剂抗性基因或所述表达盒转化多个植物细胞，并在允许表达所述除草剂抗性基因或所 述表达盒的转化细胞生长，而杀死未转化细胞或抑制未转化细胞生长的除草剂浓度下培养 所述细胞，所述除草剂为苯氧基生长素。
[0032] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制杂草的方法，包括：对种植作物的大 田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒或所述重组载 体。
[0033] 优选地，所述除草剂为苯氧基生长素。
[0034] 为实现上述目的，本发明还提供了一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的 方法，包括：将所述除草剂抗性基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物，使导入后的植 物产生足够保护其免受除草剂损害量的除草剂抗性蛋白质。
[0035] 优选地，所述除草剂为苯氧基生长素或芳氧基苯氧链烷酸酯。所述植物为大豆、棉 花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
[0036] 为实现上述目的，本发明还提供了一种控制草甘膦耐性植物的大田中草甘膦抗性 杂草的方法，包括：对种植草甘膦耐性植物的大田施用有效剂量的除草剂，所述草甘膦耐性 植物包含所述除草剂抗性基因或所述表达盒或所述重组载体。
[0037] 优选地，所述除草剂为苯氧基生长素。所述草甘膦耐性植物为单子叶植物或双子 叶植物。
[0038] 为实现上述目的，本发明还提供了一种赋予作物2, 4-D除草剂抗性的方法，包括： 将所述除草剂抗性基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物。
[0039] 优选地，所述植物为大豆、棉花、玉米、水稻、小麦、甜菜或甘蔗。
[0040] 为实现上述目的，本发明还提供了一种除草剂抗性蛋白质耐受苯氧基生长素类除 草剂的用途，所述除草剂抗性蛋白质包括：
[0041] (a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0042] (b)在（a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且 具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性的由（a)衍生的蛋白质。
[0043] 将所述的除草剂抗性基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本发明 中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射 轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
[0044] 本发明所述的2, 4-D抗性基因及其后的抗性作物提供用于在作物中控制草甘膦 抗性（或高耐性和演替的）阔叶杂草物种的优良选择。2, 4-D是广谱、相对便宜且强力的 阔叶除草剂，如果在双子叶和单子叶中同样能提供更强的作物耐受性，则可为种植者提供 优良的效用。2, 4-D耐性转基因双子叶植物还可在应用时间和用量上具有更高的灵活性。 2, 4-D除草剂耐性性状的另一用途是它可用于预防2, 4-D漂移、挥发、转化（或其它远距离 的移动现象）、误用、破坏等对正常敏