重组人cc16基因、其真核表达载体的构建及重组蛋白的纯化的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及一种利用DNA重组技术合成的人CC16基因， 及其真核表达重组质粒的构建和重组蛋白表达后的分离纯化。
【背景技术】
[0002] CC16蛋白质主要由细支气管、终末细支气管黏膜上的无纤毛柱状上皮细胞-- Clara细胞分泌产生，因其分子量约为15. 8kDa，故称为CC16蛋白，又称为Clara细胞分泌 蛋白（Clara cell secretory protein，CCSP)。CC16为组织特异性蛋白，主要在肺组织表 达，人的支气管肺泡灌洗液（BALF)中占可溶性蛋白的2%?3%。
[0003] 研宄表明，许多慢性肺部炎症性疾病的发生都与肺部Clara细胞减少及CC16含 量降低有关，如慢性阻塞性肺疾病（COPD)、哮喘等。coro是以进行性发展的气流受限为特 征的慢性呼吸道疾病，其发病机制尚未完全清楚，吸烟及细菌感染所致炎症反应是COPD发 病的主要危险因素。吸烟者支气管上皮中Clara细胞数量明显减少，支气管肺泡灌洗液和 血清中CC16含量也明显降低。Pilette C等研宄发现，与健康人比较，COro患者小气道中 Clara细胞减少，导致CC16分泌减少，BALF中CC16含量减少。在香烟烟雾制备的大鼠 COPD 模型中也观察到了相同的结果，发现气道炎症出现时Clara细胞及CC16明显减少，而CC16 减少又会引起气道抗炎能力下降，导致炎症进一步恶化。而在给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨 酸后，通过促进Clara细胞的恢复及CC16的合成和分泌抑制气道炎症反应，可以减轻COPD 的炎症。
[0004] 作为内源性的抗炎物质，CC16在肺内有很重要的免疫调节和抗炎作用，其抗炎机 制之一是抑制磷酯酶A 2 (PLA2)的活性。PLA2是存在于几乎所有有核细胞的活性酶蛋白，分 为依赖钙离子的分泌型的PLA 2(SPLA2)和胞浆型PLA2(CPLA2)及非钙依赖型PLA 2QPLA2)。 PLA2是特异性的甘油磷脂Sn-2位脂键的水解酶类，是细胞内重要的信号分子。PLA2是产生 脂类介质及血小板活化因子（PAF)的限速酶，也是炎性细胞因子的活化对象。内毒素可以 增加 PLA2的活性，进而加剧炎症反应。虽然作为内源性抗炎因子的CC16,其抗炎的具体分 子机制尚不完全清楚，但体外研宄证实，CC16可通过抑制PLA 2的活性，限制花生四烯酸代谢 和以白三烯为介导因子的级联反应，从而抑制前列腺素和白细胞介质的合成。
[0005] 因此，补充CC16以弥补慢性炎症性疾病过程中缺乏的抗炎因子，能否对疾病的发 生发展起到干预作用，就非常值得关注。而采用基因过表达技术构建CC16的真核表达质 粒，使之在肺上皮细胞中表达CC16蛋白，补充疾病过程中不足的CC16,是治疗COPD等肺部 炎症性疾病的有效尝试。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种重组人CC16基因，并构建其真核表达重组质粒，转染细 胞后生产重组人CC16蛋白质并纯化，从而为利用该重组蛋白质对炎症性肺部疾病进行干 预性治疗创造条件。
[0007] 本发明根据人CC16蛋白质的cDNA全基因序列，设计合成了重组人CC16基因，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，在基因的两端分别加入了 Kazak序列和3XFlag标签。
[0008] 本发明同时提供了一种含有上述重组人CC16基因的真核表达重组质粒，使用了 真核表达载体pMSVpuro,其带有ZAo I和及I酶切位点，将经ZAo I和及I双酶切的 重组人CC16基因与所述真核表达载体pMSVpuro连接，构成本发明的真核表达重组质粒，具 有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0009] 本发明还提供了一种包含所述真核表达重组质粒的宿主细胞，将所述真核表达重 组质粒转入HEK 293T细胞中，构建了含有所述真核表达重组质粒的真核细胞表达系统。
[0010] 本发明还提供了在HEK 293T细胞表达体系中生产所述重组人CC16蛋白的方法， 包括以下步骤： 1) 根据人CC16蛋白质对应的核苷酸序列，合成重组人CC16基因； 2) 将重组人CC16基因连接到真核表达载体pMSVpuro中，构建含有所述重组人CC16 基因的真核表达重组质粒pMSCVpuro_hCC16 ; 3) 以所述真核表达重组质粒pMSCVpur〇-hCC16转染HEK 293T细胞，构建含有重组人 CC16基因的HEK 293T细胞表达系统； 4) 在所述HEK 293T细胞表达系统中，无血清培养基体系下培养表达重组人CC16蛋 白； 5) 分离并纯化所述重组人CC16蛋白。
[0011] 其中，所述步骤2)中的真核表达载体pMSCVpuro经沿ο I和及I双酶切后与 同样经双酶切的重组人CC16基因连接。
[0012] 本发明中，所述的HEK 293T细胞是在含有10%新生牛血清，100u/ml青霉素， 100ug/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，37°C和5%C02条件下生长，3?4天换液一次。
[0013] 进一步地，所述生产重组人CC16蛋白的方法中，所述步骤3)中，在转染24小时后 加入终浓度为1. 5 μ g/ml的嘌呤霉素，细胞培养48小时，以筛选出稳定表达的细胞克隆。
[0014] 更进一步地，所述步骤5)的分离并纯化具体包括以下步骤： 收集步骤4)的无血清培养基上清； 剩余细胞用PBS洗涤，得到稳定转染pMSCVpuro-hCC 16的细胞，以蛋白裂解液孵育 30min，收集细胞裂解液； 将收集的细胞裂解液与无血清培养液离心，收集上清，4°C下加入预先用TBS平衡的 ANTI-FLAG M2亲和凝胶中，使蛋白与凝胶孵育过夜； 以TBS洗掉亲和凝胶上的未结合蛋白后，再用洗脱液洗脱亲和凝胶上结合的目的蛋 白，洗脱液中加入0. 5M Tris HC1，pH7. 4 ;1. 5M NaCl，使用截留分子量3kDa的浓缩管浓缩 目的蛋白，得到纯化的重组人CC16蛋白。
[0015] 其中，所述的蛋白裂解液含有 50mM Tris-HCl，pH7. 4 ;150mM NaCl ;lmM EDTA ; 1%TRIT0N X-100 ;所述 TBS 含有 50mM Tris HCl，150mM NaCl，pH7.4 ;所述洗脱液为 0· IM 甘 氨酸-HC1，pH3. 5。
[0016] 本发明合成了经修饰的重组人CC16基因，在其羧基端加入3XFlag标签序列，并 将其连接入真核表达载体pMSCVpuro中，成功构建了真核表达重组质粒pMSCVpur〇-hCC16， 并使人CC16基因在HEK 293T细胞中成功表达。
[0017] 本发明采用亲和纯化的方法，获得了纯度大于99%的重组人CC16蛋白，达到了工 业生产的要求。
[0018] 本发明获得的重组人CC16蛋白能够抑制PLA2的活性，说明获得的重组蛋白具有 生物学活性，这就为研宄重组人CC16蛋白的抗炎功能，特别是在肺部炎症性疾病中的干预 作用奠定了基础。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明真核表达重组质粒pMSCVpur〇-hCC16的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳 图。
[0020] 图中，M :DNA 分子标记；1 ?3 :pMSCVpur〇-hCC16 ;4 :阴性对照。
[0021] 图2为本发明真核表达重组质粒pMSCVpur〇-hCC16双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳 图。
[0022] 图中，M :DNA分子标记；1?2 :pMSCVpur〇-hCC16酶切产物。
[0023] 图3为本发明重组人CC16蛋白在宿主细胞中表达的Western blotting检测图。
[0024] 图中，I :pMSCVpur〇-hCC16质粒转染蛋白；2 :pMSCVpuro质粒转染蛋白。
[0025] 图4为纯化的重组人CC16蛋白的SDS-PAGE检测图。
[0026] 图5为重组人CC16蛋白对PLA2活性的抑制效果。
【具体实施方式】
[0027] 本发明实施例1?5中所使用的构建材料和主要试剂的来源。
[0028] 真核表达载体：pMSVpuro,购自美国Clontech公司。
[0029] HEK 293T细胞，购自北京协和医学院基础所细胞中心。
[0030] 大肠埃希菌Topl0、2 X Taq PCR Master Mix、T4 DNA连接酶，购自北京全式金生 物技术有限公司；DL 2000 DNA Marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、RIPA蛋 白提取液、BCA蛋白定量试剂盒，购自北京博大泰恒生物技术有限公司；兔抗人CC16多克隆 抗体，购自美国Abcam公司；人抗Flag单克隆抗体、人抗β-actin单克隆抗体，购自华大基 因有限公司；限制性内切酶I和通 〇1，购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；蛋白 Marker，购自上海博谷生物技术有限公司；辣根酶标记的山羊抗人（兔）IgG，购自北京中山 金桥有限公司；Entranster-D转染试剂、ECL发光液，购自北京英格恩公司；M 2 Flag-beads 购自美国sigma公司。
[0031] 其他试剂为国产分析纯。
[0032] 实施例1 采用基于PAS(PCR_based Accurate Snthesis)的方法，根据人CC16蛋白质编码基因 (基因登录号：U01101. 1)，设计重组人CC16基因序列，合成基因全长拼接引物，在引物两端 各设计保护碱基，5'端加入GCCACC(Kazak序列），3'端加入3XFlag标签。基因序列