的上游构建体。
[0020]所表示的醛脱氢酶有:向3 -羟基丙醛的高比活性，是非常稳定的，在主机中的表示方法；容易过度表达在选定的主机不能抑制不论是由底物的反应所必需的或形成的产品通过反应；，完全活跃最有利的生产3 -羟基丙酸的发酵条件下，可以使用任一 NAD.sup。+ 或 NADP.sup。
[0021]一种可能的方式是真正的操纵子，其中启动子是用来直接在一个方向上的所有必要的开放阅读框(ORF)的转录。然后整个消息中包含一个信使RNA。的操纵子的优点是，它是比较容易构造，由于只有一个启动子是必要的，这是它是相对简单，以取代与其他启动子的启动子，如果这将是可取的购买，保证这两个基因根据相同的调控。操纵子的方案的主要缺点是，不能独立地变化的两个基因的表达水平。如果发现的基因，以获得最佳的3 -羟基丙酸合成，应在不同的高度来表示，在大多数情况下，操纵子不能被用于实现这一。
[0022]另一种可能的方式是多启动方案。与相同或不同的管理行为，两个或两个以上的启动子，可以使用直接的基因的转录。例如，一个启动子，可以使用直接DHAB和适当的醛脱氢酶的编码基因的直接转录的转录。因为基因在理论上可以被转录和翻译分开，大量的多个启动子的组合是可能的。此外，这将是最可取的，以防止启动子彼此干扰。这可以实现，或者通过将两个启动子的构建体，例如到，他们直接转录在相反的方向，或者通过各独立的转录单元的下游插入转录终止子序列。的多个启动子的构建体的主要优点是，它允许尽可能多的不同的单元的独立调节所需的，这可能是重要的。缺点是，这将是更难以建立，更难以修改以后，更难以有效调节，因为多个发酵条件的变化，还需要引进，还有可能使发酵的性能稍差预见的。
[0023]在任一构造中，启动子序列(S)，用于在选定的宿主有机体中应该是功能，优选提供足够的包括甘油，3 -羟基丙酸途径，以使构造充分的活性，在该主机上的基因的转录。也会影响子序列3-HP通路，使甘油3-HP生产的发酵条件下充分活跃的基因的转录调控，最好将诱导，这样表达基因可以纳入或排除一定的代理或条件，发酵调制。
[0024]一个可能的例子，使用这样的构造如下:一个促进剂，它由一种廉价的化学(诱导剂)，向培养基中加入诱导，可以控制DHAB基因与适当的醛脱氢酶的编码基因的转录。直到他们累计到预定电平，将被允许在缺乏诱导剂的情况下生长的细胞。诱导剂添加到发酵，将作出改变代谢与营养变化以及介质。然后将这些细胞可利用3-HP生产(和额外的生物质生产，如果需要的话)提供了在基板(次)。细胞后可不再使用基体产生3-HP，发酵停止，3-HP回收。
[0025]基因序列
表达甘油脱水酶和合适的醛脱氢酶，从甘油3 -羟基丙酸的生产所必需的两种酶，它是必需的DNA序列，含有的甘油脱水酶，醛脱氢酶编码序列与至少一个启动子序列相结合(最好的非本地子虽然一些本地的启动子活性，可能存在的)。在下面的例子中描述的示例性的施工方法。，以确保使本说明书中，这些酶的基因的编码区的全部序列的是这里。序列1，3，5和7本不同的本地醛脱氢酶基因的基因组序列。
[0026]这些编码序列中的每一个可以被用来做适当的酶在异源宿主中的表达的基因构建。在这样的宿主中的基因表达的基因构建体，它设想将被加入的酶的编码序列的异源启动子，但它需要的是，启动子是有效的，其中的基因是主机得以表达。还可以设想，设想从这里提出的天然DNA编码序列，在DNA序列中的显着变化是可能的。如众所周知，由于遗传密码的简并性，在本领域中，许多不同的DNA序列可以编码相同的蛋白质的表达。所以，当指定编码的蛋白质的DNA序列的本文档中使用的语言，它旨在包含可用于表达该蛋白质的任何DNA序列，即使这里介绍的不同的基因组序列。还可以设想，此处指定的蛋白质的氨基酸序列的保守的变化，可以在不脱离本发明的。特别是，在蛋白质序列中的一个或多个氨基酸的缺失，添加和替换的几乎总是可以不改变蛋白质的功能的情况下作出。当一种蛋白质的名称被起诉在这里，它的目的是同样适用于这两种氨基酸序列的微小的变化，并在天然蛋白质序列的等位基因变异，如发生于命名的物种，以及其他密切相关的物种。
[0027]这可能是许多上述的DNA序列可以被截断，并且仍然表达的蛋白质具有相同的酶学性质。能够明白，本领域技术人员在现有技术中的分子生物学轻微缺失，添加和突变可能不会改变指定的喊基对序列的属性；指定的喊基对序列的喊基许多可能不是必需的，其独特的功能。改变的序列或序列，以确定是否有足够的同源性的碱基对与所指定的相同的功能，如简单地创建候选突变，删除或修改，创建的基因构建，包括修改过的序列与启动子和终止序列。该基因构建体可能被测试，如下面所述，对于从甘油生产3-HP。
[0028]某些DNA引物，使用下面描述的实验中使用的基因组DNA序列的分离或克隆。虽然这里介绍的是足以使建设纳入这里确定的基因的表达质粒，以冗余启用使用这些基因的序列信息，可被用来隔离从它们原来的主机的基因的引物如下所述。
[0029]替代醛脱氢酶和甘油脱水酶
从甘油生产3 -羟基丙酸的途径中的应用，可以使用其它合适的醛脱氢酶。在这个通路的醛脱氢酶需要保持稳定的功能，容易地表示在主机给出，向3 -羟基丙醛具有足够高的活性，以使其能够使3-HP。本发明的知识，使有关修订可能。一个程序，可以采取定向进化选择合适的醛脱氢酶，或者他们可以从本地源收回，配合适当的甘油脱水活性的基因编码，编码这些酶的基因，然后进行任何结构的一部分这里设想从甘油生产3 -羟基丙酸。
[0030]进行类似的酶的改进方案可以包括，例如，定向进化作为一个起点，使用DHAB基因的肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶是优异的效率和稳定性在本发明中使用的形式取得的其它变体。另外，酶催化相同的反应可以从其他生物体中分离，肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶代替使用。这样的酶可能是特别有用的，在替代的主机，其特征在于，它们可以更容易地表达，最适合于构建体的生长和3-HP的生产和回收的发酵条件下更稳定和更高效。
【主权项】
1.重组生物体3-羟基丙酸的制备方法，包括以下步骤:提供在发酵罐中的重组微生物，它带有一个的遗传构建表达DHAB基因的肺炎克雷伯氏菌，和醛脱氢酶的基因，这是能够催化生产3 -羟基丙酸，甘油，提供了一个源的重组微生物，甘油或葡萄糖，发酵的微生物的条件下，这会导致在发酵罐中的溶液中的3 -羟基丙酸的积累。
2.根据权利要求1所述，其特征在于，包括在其遗传基因材料肺炎克雷伯菌和醛脱氢酶的基因，如主机能够从甘油生产3 -羟基丙酸国外DHAB基因的重组大肠杆菌宿主。
3.根据权利要求1所述，其特征在于，重组大肠杆菌宿主包括在其可继承的遗传物质，DHAB基因的肺炎克雷伯菌和ALD4基因等酵母菌，主机是能够从甘油生产3 -羟基。
4.根据权利要求1所述，其特征在于，甲细菌宿主在其可继承的遗传物质包括DHAB肺炎克雷伯菌和醛脱氢酶基因的表达，编码一个基因工程，使得细菌宿主是能够变换甘油3 -羟基丙酸。
5.根据权利要求1所述，其特征在于，甲细菌宿主，包括在其可继承的遗传物质的甘油脱水酶编码的遗传施工中，其中的氨基酸序列选自SEQ利和N0:10，ll，12和13，和醛脱氢酶，使得细菌宿主是能够转换甘油醛脱氢酶，其特征在于，所述选自选自SEQ ID N0:2, SEQID NO:4, SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:8 的 3 -羟基丙酸。
6.根据权利要求1所述，其特征在于，甲细菌宿主，它包括在其可继承的遗传物质的甘油脱水酶的表达，其中的选自序列的IDS NO:10，11，12和13，和醛脱氢酶的氨基酸序列中，一个基因结构编码等细菌宿主能够将甘油醛脱氢酶基因，其特征在于，所述的3 -羟基丙酸的ALDH2 ALDA4的，阿尔达和aldB组成的组中选择。
【专利摘要】重组生物体3-羟基丙酸的制备方法,在细菌宿主中的甘油的生产3-羟基丙酸（3-HP）进行说明。3-HP是一个有用的聚合材料的生产原料。两种酶的基因工程细菌宿主是足以使生产的3-HP。一个酶是一种甘油脱水酶，另一种是乙醛脱氢酶。允许创建的重组微生物宿主，其能够从甘油或葡萄糖为起始原料合成3-HP。甘油或葡萄糖转化，然后转换为3-HP。此过程需要所谓的DHAB从肺炎克雷伯菌的基因，其编码的酶甘油脱水四个不同的醛脱氢酶基因中的任一项的转换3-HPA3-HP。四醛脱氢酶基因从细菌大肠杆菌，ALDH2的人类，从酿酒酵母，大肠杆菌aldBALD4阿尔达。酵母基因出现，以得到最佳的效果。
【IPC分类】C12P7-42
【公开号】CN104611383
【申请号】CN201310537862
【发明人】不公告发明人
【申请人】新昌县冠阳技术开发有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2013年11月4日