一种利用固定化细菌生产罗伊氏素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种利用固定化细菌生产罗伊氏素的方法。
【背景技术】
[0002] 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)常栖息于人和动物的肠道系统中，对人 和动物无害，具有良好的生物相容性。它代谢甘油产生一种特殊的抑菌物质一一罗伊氏素 (reuterin)。罗伊氏素是一种广谱抗菌剂，可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉 菌、病原虫、原生动物等的生长，不仅可以有效作用于细菌，同样也可以作用于某些真菌和 原生动物。罗伊氏素的主要成分是3-羟基丙醛（3-HPA)的单体、水合物和环化二聚体。除 了抗菌外，3-HPA单体还是一种潜在的重要化工原料，可作为多种新兴化学品如丙烯醛、丙 烯酸、1，3-丙二醇等的前体，用于制备新型聚合物材料；可和蛋白质中的氨基反应形成交 联，有望取代化学合成的戊二醛和环氧化合物作为新型生物交联剂。
[0003] 磁性纳米离子具有超顺磁性，低毒性以及生物相容性等优点，近年来，越来越多的 被应用在药物靶向运输，环境修复以及磁流体等研宄领域。PEG是一种亲水性的生物相容性 化合物，PEG修饰后的磁性纳米离子不仅可以减少其生物毒性也能防止Fe 3O4被氧化。
[0004] 相对于游离细胞来说，固定化细胞减少了氧气的传递，利于厌氧反应的进行。磁性 纳米离子具有大的比表面积以及超顺磁性，既可以解决传统固定化细胞反应中物质运输困 难的问题还促进了细胞的重新利用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用固定化细菌生产罗伊氏素的方法。
[0006] 本发明所提供的生产罗伊氏素的方法，具体可包括如下步骤：
[0007] (1)采用含有磁性纳米颗粒和卡拉胶的混合物对罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)进行固定，得到固定有所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)的胶粒；
[0008] (2)配制含有步骤（1)所得胶粒的反应体系，将所述反应体系于30°C静置反应2h， 从反应液中获得罗伊氏素；
[0009] 在所述反应体系中，含有终浓度为200-250mmol/L (如250mmol/L)的甘油。
[0010] 在所述方法的步骤（1)中，所述采用含有磁性纳米颗粒和卡拉胶的混合物对罗伊 氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)进行固定的方法包括如下步骤：制备含有所述磁性纳 米颗粒、所述卡拉胶和所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)的固定体系。
[0011] 所述磁性纳米颗粒在所述固定体系中终浓度具体为9g/L。在本发明中，所述磁 性纳米颗粒具体为经PEG修饰的Fe 3O4纳米颗粒。所述卡拉胶在所述固定体系中浓度具体 为20g/L。所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)在所述固定体系中含量具体为 1. 8±0· 7X108cfu/L。
[0012] 在本发明中，每9ml所述固定体系的组成如下：8ml水（超纯水）、81mg所述经 PEG修饰的Fe3O4纳米颗粒、180mg所述卡拉胶、I. 62±0. 7X 10 6cfu所述罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)，余量为 pH 6.2 磷酸缓冲液。
[0013] 在本发明中，所述经PEG修饰的Fe3O4纳米颗粒中的PEG具体为PEG-1000。在所 述经PEG修饰的Fe 3O4纳米颗粒的制备过程中，所述Fe 304与PEG的配比为0. 29g : lg。
[0014] 更加具体的，所述经PEG修饰的Fe3O4纳米颗粒具体是按照包括如下步骤的方法制 备得到的：（al)将Fe 3+(如氯化铁、硫酸铁或硝酸铁）和Fe2+(如氯化亚铁、硫酸亚铁或硝酸 亚铁）按照摩尔比为3:2的比例混合后调节pH至10 (如采用氨水进行pH调节），60°C磁 力搅拌15min。（a2)加入PEG-1000, PEG-1000的加入量与步骤（al)中Fe3+的配比为12g PEG-1000:0. 015mol Fe3+，搅拌反应lh。（a3)反应后，水洗至pH恒定。（a4)使用梯度离心 的方法，先使用IOOOrpm的转速除去大颗粒杂质，在使用8000rpm-10000rpm的转速除去小 颗粒杂质，直接得到均匀悬浊液，即为所述经PEG修饰的Fe 3O4纳米颗粒。
[0015] 在所述方法的步骤（1)中，所述采用含有磁性纳米颗粒和卡拉胶的混合物对罗伊 氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)进行固定的方法，在配制完所述固定体系后还包括如 下步骤：待所述固定体系凝固后切割成胶粒，置于30g/L的KCl水溶液中浸泡2h，从而完成 对所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)的固定。
[0016] 在所述方法的步骤（2)中，所述反应体系中还可含有Mg2+(如MgSO 4)、维生素 B12和 葡萄糖。
[0017] 在本发明中，所述Mg2+(如MgSO4)在所述反应体系中的终浓度具体为lOmmol/L ; 所述维生素 B12在所述反应体系中的终浓度具体为0. 02g/L ;所述甘油在所述反应体系中的 终浓度具体为250mmol/L ;所述葡萄糖在所述反应体系中的终浓度具体为37. 5mmol/L ;所 述固定有所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)的胶粒在所述反应体系中的含量为 1. 8±0· 7X 108cfu/L(以所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)的量计）。
[0018] 在所述方法的步骤（2)中，所述反应体系的液体环境具体可为PH6. 2磷酸缓冲液。 其中，所述pH 6. 2磷酸缓冲液的组成如下：每IOOmL所述pH 6. 2磷酸缓冲液中含19. 2mL 0. lmol/L K2HPO4,80. 8mL 0. lmol/L KH2PO40
[0019] 在本发明的一个实施例中，所述反应体系组成具体如下：每IL所述反应体 系中含有 IOmmol Mg2+(如 MgSO4)、0. 02g 维生素 B12、250mmol 甘油、37. 5mmol 葡萄糖、 1. 8±0.7X IO8Cfu所述固定有所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)的胶粒（以所 述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)的量计）；余量为所述pH6. 2磷酸缓冲液。
[0020] 在所述方法的步骤⑴中，被固定的所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)是采用发酵培养基培养后得到的；所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度为： 酵母粉24g/L，葡萄糖24g/L，柠檬酸铵2. 4g/L，醋酸钠6. 2g/L，磷酸氢二钾I. 8g/L，硫酸锰 0. 16g/L，硫酸镁0. 21g/L，吐温800. 8g/L ;pH 6. 3。进一步，采用所述发酵培养基进行培养 的温度为40 °C。
[0021] 本发明的另一个目的是提供一种用于生产罗伊氏素的试剂盒。
[0022] 本发明所提供的用于生产罗伊氏素的试剂盒，含有所述胶粒、所述罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)、甘油；当然还可含有记载有前文所述方法的说明书。
[0023] 在本发明中，以上所有所述罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)均具体为罗 伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)CGMCC No. 1.3264。
[0024] 实验证明，采用本发明所提供的方法，利用固定化细菌生产罗伊氏素与传统方 法利用游离细菌生产罗伊氏素相比，本发明的方法显著提高了作为底物的甘油的转化 率，使罗伊氏素的产量得到大幅度提升。另外，本发明所采利用菌株一一罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)为生物安全菌株，可直接用于食品领域；并且利用该方法制备的 细胞催化剂具有磁性，可以很方便的从水相中分离菌体，便于罗伊氏素的纯化，固定化的细 胞催化剂可以重复利用，降低了成本。
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri):购自中国普通微生物菌种保藏管理中 心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏编号为 1. 3264。
[0028] 实施例1、发酵培养基及培养条件优化
[0029] 运用响应面分析法（response surface methodology RSM)中 Plackett-Burman 设计选出对响应值影响较大的因素，然后采用BOX-Benhnken design(BBD)进行实验，通过 实验数据拟合得到二阶响应面模型，最终确定最优实验条件，进行验证实验。其中，以菌体 的〇D_为响应指标，培养基配方中所有指标，以及培养温度都进行优化，实验的设计主要是 用design expert软件完成。
[0030] 最终确定最优发酵培养基的配方如下：酵母粉24g/L，葡萄糖24g/L，梓檬酸按 2. 4g/L，醋酸钠6. 2g/L，磷酸氢二钾I. 8g/L，硫酸锰0· 16g/L，硫酸镁0· 21g/L，吐温800. 8g/ L，pH 6. 3。最优培养温度为40°C。
[0031] 实验验证，采用如上确定的最优发酵培养基（初始pH6. 3)于40°C静止培养罗伊氏 乳杆菌（Lactobacillus reuteri)CGMCC No. L 3264,菌体最大生长量可达为 0D_= 13. 2〇
[0032] 实施例2、固定化试剂优化
[0033] 1、待固定菌体的准备
[0034] 将罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri) CGMCC No. L 3264接种于实施例1确 定的最优发酵培养基（初始PH6. 3)中，于40°C静