快速鉴别三叶青及其多种伪混品的pcr-rflp方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及一种快速鉴别三叶青及其伪混品的 PCR-RFLP 方法。
【背景技术】
[0002] 三叶青（Tetrastigma hemsleyanum)又名金线吊萌芦，是葡萄科崖爬藤属多年生 草本植物，其地下块根为主要药用部位，可用于治疗高热、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑 膜炎等多种疾病，也是抗肿瘤常用药物。目前该植物野生资源濒临灭绝，且其对生长环境 的要求非常苛刻，人工栽培难度大，开发和利用受到极大限制。由于资源稀缺而需求量大， 三叶青价格不断攀升，药材市场上出现了土圈儿、大青藤、乌头子根等多种伪混品，药材质 量极不稳定，甚至发生了患者服用混有乌头子根的假劣三叶青药材中毒的现象。为保证中 药药材质量和用药安全，对三叶青药材基原植物的鉴定非常重要。
[0003] 目前中药材传统的鉴定手段大多采用的是依据其外部形态和显微结构，但是由于 植物子根类药材大多外部形态相似，且经过产地粗加工和饮片炮制后，难以看出其本身的 形状和颜色，显微特征也有不同程度的破坏，造成鉴定困难。中药材种质分子鉴定技术不受 生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，直接利用DNA序列进行物种的鉴定，具有独一 无二的准确性和可重复性，且所用引物少，稳定性及通用性高，实验过程标准化，操作简单 快速。中国专利申请201310373809. 4公开了一种鉴定药用植物三叶青的方法，这是基于 ISSR分子标记的三叶青分子鉴定方法。该技术通过一对特异性引物扩增与否可成功鉴别 三叶青常见伪混品，但对其某些近缘物种也有阳性结果，区分度不高，且未验证在大青藤、 乌头子根等常见伪混品鉴定中的适用性，另外需要事先合成一对特异性引物。植物核rDNA 的内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS)包含被5. 8SrDNA所分隔的ITSl和 ITS2两个片段，PCR扩增已有通用引物序列，且测序简单易行，ITS序列变异较快，可以提供 较丰富的变异位点和信息位点。PCR-RFLP用于近缘种的鉴别已有一些成功范例，具有快速、 简单、准确等优点，但这种鉴别对不同的物种，所用的引物、PCR扩增条件、限制性内切酶的 种类及鉴别方法都不相同。目前尚没有应用PCR-RFLP技术对三叶青进行分子鉴别的报道。
[0004] DNA条形码技术是通过对一个标准目的基因的DNA短片段进行分析，从而快速、准 确地进行物种鉴定的技术。DNA条码概念是2003年由加拿大动物学家Paul Hebert首先提 出，利用有足够变异且容易扩增的相对较短的标准DNA片段，在种内的特异性与种间的多 样性中建立的一种新的生物身份识别系统，从而实现了对物种进行快速、准确的识别和鉴 定。DNA条形码的理想序列有3个基本判断标准：（1)序列变异水平适宜，可以将不同物种 彼此区分开来，同时种内变异较小；(2)变异区域两端的序列高度保守，可以设计在众多物 种中稳定扩增的通用引物；（3)扩增序列尽量短，最好一个反应可以完成测序。
[0005] DNA条形码不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响，直接利用DNA序列进 行物种的鉴定，具有独一无二的准确性和可重复性，且所用引物少，稳定性及通用性高，实 验过程标准化，并可通过数据库实现共享并可将DNA序列转换成二维条形码图像应用于实 践。迄今热点候选序列有rbcL、matK、psbA-trnH、ITS2等，但还未获得广泛通用的植物DNA 条形码标准片段。符渊森等研宄发现ITS、bcL+matK+ITS是鉴定三叶青和其它崖爬藤属植 物的最佳条形码，三叶青可以被 ITS、ITs+rbcL、ITS+matK、ITs+trnH-psbA、matK+rbcL、； bcL+trnH-psbA及2+x组合条形码准确鉴定（《药用植物三叶青的种质鉴定和组培快繁研 宄》，浙江大学硕士学位论文，2011年）。该方法首先需要提取植物DNA，再进行PCR扩增，通 过对扩增产物测序和比对才能判断该植物的种类，不适合快速鉴定。目前Genbank中只有 其它崖爬藤属植物毛枝崖爬藤、扁担藤等的ITS2基因序列，还没有三叶青ITS2的相关基因 序列，因此本领域特别需要建立中药三叶青的快速鉴定方法。
[0006] 本发明提供的PCR-RFLP方法能实现三叶青的快速鉴定，提高鉴定结果的准确性。
【发明内容】
[0007] 为了建立中药三叶青及其伪混品的快速鉴定方法，实现中药三叶青的DNA条形码 检测，本发明通过以下方法实现本发明的目的。
[0008] 建立了一种快速鉴别三叶青及其多种伪混品的PCR-RFLP方法，包括提取药材DNA 和琼脂糖凝胶电泳分析，用一对扩增核糖体DNA的内转录间隔区（ITS2)序列的正反向引物 进行PCR扩增及用限制性内切酶消化PCR产物，根据酶消化产物琼脂糖凝胶电泳分析结果 判断药材三叶青的真伪及是否掺入了伪混品。
[0009] 本发明所述PCR扩增基因为核糖体DNA的内转录间隔区（ITS2)，具有SEQID NO. 1 所述的基因序列。
[0010] 本发明PCR扩增引物具有SEQID NO. 2和SEQID NO. 3所述的核苷酸序列。
[0011] 使用的限制性内切酶为Nco I，其识别序列为CCATGG。
[0012] PCR扩增的基因片断大小为400?600bp，其中优选的为490?550bp，特别优选的 为 533bp。
[0013] 限制性内切酶消化后药材三叶青样品电泳分析出现335bp和200bp条带，而其伪 混品的DNA扩增产物不被限制性内切酶消化。
[0014] 本发明所述的PCR反应条件为：95°C预变性5min ;然后进入循环，95°C变性30秒， 45?55 °C退火30秒，72°C延伸40秒，25?35个循环；最后72°C延伸10分钟。其中优选 的退火温度为55°C，优选的PCR循环为35个。
[0015] PCR扩增产物的限制性内切酶酶切反应条件为：10 yL PCR产物，2 yL IOX酶切 缓冲液，8 μ L灭菌超纯水，5?25U限制性内切酶，20?37°C恒温2?8小时，其中优选的 限制性内切酶加入量为20U，反应温度37°C，时间为4小时。
[0016] 本发明提供的快速鉴别三叶青及其伪混品的PCR-RFLP方法能实现三叶青的快速 鉴定，提高鉴定结果的准确性，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
[0017] 1、本发明所提供的方法能快速有效的实现三叶青的真伪鉴定。与传统的形态学鉴 定方法及其它分子标记方法相比，能有效缩短三叶青的鉴定时间，采用本发明方法鉴定需 要6?8h时间，达到了快速鉴定的目的，因为利用DNA序列差异进行物种的鉴定，具有独 一无二的准确性和可重复性，且所用引物少，稳定性及通用性高，增加了对近缘物种的分辨 率，大大增加了鉴定的准确性。
[0018] 2、本发明提供了鉴定所需的一对PCR通用引物的反应条件、一种限制性内切酶及 酶切反应条件，与现有的三叶青分子鉴别方法相比，本发明对市场上目前发现的所有三叶 青伪混品以及其同属近缘物种均能实现有效鉴别。
【附图说明】
[0019] 图1是琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物结果；
[0020] 泳道 I :DNA Marker，自上而下 400bp、500bp、700bp、900bp、1500bp ;
[0021] 泳道2 :来自浙江丽水三叶青样品；泳道3 :来自浙江温岭三叶青样品；
[0022] 泳道4 :来自浙江象山三叶青样品；泳道5 :来自广西田林三叶青样品；
[0023] 泳道6 :来自广西乐业三叶青样品；泳道7 :来自湖南邵阳三叶青样品；
[0024] 泳道8 :来自湖南益阳三叶青样品；泳道9 :来自湖南沅陵三叶青样品；
[0025] 泳道10 :来自江西万安三叶青样品；泳道11 :来自江西上饶三叶青样品；
[0026] 泳道12 :土圈儿样品； 泳道13 :乌头样品；
[0027] 泳道14 :大青藤样品； 泳道15 :三叶青近缘植物扁担藤样品；
[0028] 泳道16 :三叶青近缘植物毛枝崖爬藤样品。
[0029] 图2是三叶青样品PCR产物测序部分序列；
[0030] 图3是琼脂糖凝胶电泳分析限制性内切酶消化PCR产物结果；
[0031] 泳道 I :DNA Marker，自上而下 400bp、400bp、500bp、700bp、900bp、1500bp ;
[0032] 泳道2 :来自浙江丽水三叶青样品；泳道3 :来自浙江温岭三叶青样品；
[0033] 泳道4 :来自浙江象山三叶青样品；泳道5 :来自广西田林三叶青样品；
[0034] 泳道6 :来自广西乐业三叶青样品；泳道7 :来自湖南邵阳三叶青样品；
[0035] 泳道8 :来自湖南益阳三叶青样品；泳道9 :来自湖南沅陵三叶青样品；
[0036] 泳道10 :来自江西万安三叶青样品；泳道11 :来自江西上饶三叶青样品；
[0037] 泳道12 :土圈儿样品； 泳道13 :乌头样品；
[0038] 泳道14 :大青藤