一种as-pcr技术引物设计方法、基因突变检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种AS-PCR技术引物设计方法、基因突变 检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 基因突变（gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或替换，而 引起的基因结构的改变。野生型基因通过突变成为突变型基因。从分子生物学的角度，恶 性肿瘤可视为基因的疾病，是因某些染色体上的DNA损伤致使基因突变的结果，导致细胞 的生长失控、缺乏分化而异常增生，并可侵犯正常组织和器官，最终可散布全身。肿瘤是由 基因突变而导致异常增生的单个细胞，这种异常增生细胞克隆出来的后裔所形成。在肿瘤 进展过程中，肿瘤细胞群中常有另外的基因突变发生，授予细胞选择性优势，例如更快速的 生长，或具有侵犯和转移的特性，使它们在肿瘤细胞群中占据优势（成为显性），该过程称 为克降性选择。通过克隆性选择，肿瘤变得更快速生长和增加恶性表型。
[0003] 目前体细胞突变的检测方法主要有DNA测序法、等位基因特异 PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)和等位基因特异扩增（ASA，Allele-specific enzymatic amplification)等技术方法，其中 AS-PCR 又称作 ARMS (Amplification refractory mutation system)。DNA测序法是进行突变检测的可靠方法，也是使用最多的 方法。然而测序法对取材和技术要求比较高，更重要的是，由于测序方法本身的限制，灵敏 度不高，只能对含量大于20%的突变基因进行检测。AS-PCR的原理是根据3'端错配原则， 在进行扩增反应时，若3'端碱基对形成错配，链延伸反应就会因3'，5'二磷酸二酯键形 成的障碍而受阻。在AS-PCR中，PCR的引物之一或者两个引物被设计成在序列变异的位点 处退火，使其能够区分同一基因的不同等位基因，这些等位基因类型包括碱基的替换、插入 和缺失。AS-PCR利用了 DNA聚合酶的保真度：相比于3'端最后一个碱基正确匹配引物而 言，3'端最后一个碱基错配的引物在延伸效率上大大降低（通常为1/100至1/100, 000)。3' 端最后一个碱基错配的引物由此导致延伸困难，PCR扩增减少，因此很容易通过检测区分突 变。因此，只有模板链是特定的等位基因时，才会检测出特异的扩增产物。在AS-PCR (ARMS) 的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素,或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为 基础的基因分型方法。可检测出样品中含量低至〇. 1-1.0%的突变基因。目前，该方法已成 为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业 内专家广泛认可。目前，全球只有两家企业拥有ARMS技术和相应产品，分别是厦门艾德生 物医药科技有限公司拥有自主知识产权的环形引物双扩增技术（ADx-ARMS)和英国DxS公 司的蝎形探针扩增阻滞突变系统（scorpionARMS)技术。
[0004] 在具体使用过程中，研究人员发现，现有技术中AS-PCR方法的主要限制因素是， 若突变的位点为弱错配碱基序列，该方法的特异性将受到影响。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种有效降低因突变位点强弱错 配而导致的每个突变位点的AS-PCR引物特异性的差异性的AS-PCR引物设计方法。
[0006] 本发明的AS-PCR技术引物设计方法，包括以下步骤：
[0007] 1)针对包含待测等位基因突变区域的靶序列设计AS-PCR引物；
[0008] 2)针对AS-PCR引物设计竞争阻断引物，所述竞争阻断引物为与AS-PCR引物反向 互补的寡核苷酸。
[0009] 进一步的，所述竞争阻断引物与所述AS-PCR引物的长度一致。
[0010] 进一步的，所述AS-PCR引物的：V末端第2和/或第3个碱基处引入与靶序列错 配的碱基。
[0011] 当竞争阻断引物浓度在过量的情况下，会与靶序列（模板DNA)形成竞争作用，等 位基因 AS-PCR引物会与过量的竞争阻断引物（competitive blocker)结合形成二聚体而 被封闭，但在退火条件下，该二聚体变得不稳定开始解离，AS-PCR引物会与竞争阻断引物 分开，然后与3'末端匹配的模板DNA完全结合并在酶的作用下继续扩增。众所周知的是， AS-PCR引物包括上游引物和下游引物，其中一条引物的3'端最后一个碱基与突变碱基互 补，在AS-PCR中，PCR的引物之一被设计成在序列变异的位点处退火，因此，竞争阻断引物 通常设计为一条，与AS-PCR引物中包含突变碱基的一条反向互补。
[0012] 本发明还提供一种AS-PCR基因突变检测方法，包括以下步骤：
[0013] 1)针对包含待测等位基因突变区域的靶序列设计AS-PCR引物；
[0014] 2)针对AS-PCR引物设计竞争阻断引物，所述竞争阻断引物为与AS-PCR引物反向 互补的寡核苷酸；
[0015] 3)使用步骤1)和2)设计的AS-PCR引物和竞争阻断引物进行PCR扩增。
[0016] 4)分析步骤3)的扩增结果确定基因突变信息。
[0017] 进一步的，步骤3)中，PCR扩增时所述竞争阻断引物的浓度为AS-PCR引物浓度的 2-8 倍。
[0018] 本发明还提供一种AS-PCR基因突变检测试剂盒，包括AS-PCR引物、竞争阻断引 物、TaqMan探针、内控引物、内控探针、聚合酶、dNTP和缓冲液，其中，所述AS-PCR引物为针 对包含待测等位基因突变区域的靶序列设计而成，所述竞争阻断引物为针对AS-PCR引物 设计而成，并且所述竞争阻断引物为与AS-PCR引物反向互补的寡核苷酸。
[0019] 本发明的另一个目的是提供一种采用上述方法和试剂盒来检测癌症相关基因突 变的试剂盒。在许多肿瘤中κ-ras基因的突变率较高，在白血病、肺癌、直肠癌和胰腺癌等 癌症中，k-ras突变均很常见，近年来研究显示K-ras基因活性物与细胞增殖、凋亡之间关 系密切。突变K-ras基因使本应正常死亡的细胞的生存期延长，K-ras基因过度表达还能 增加抗药物和紫外光诱导的凋亡，可能的机制是K-ras基因增强了细胞分解过氧化氢的能 力从而抑制凋亡。K-ras基因能够根据激活信号的强度和质量、细胞类型和代谢环境诱导细 胞抗凋亡通道，因此对K-ras基因突变的检测将有助于控制肿瘤细胞生长和凋亡制定出有 效的治疗方案。K-ras突变结直肠癌和非小细胞肺癌中突变率分别可达30?60%和21? 28%。同时在上述两种肿瘤中约80?90%的K-ras基因突变发生在突变热点2号外显子 12、13密码子上。《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因如果 发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向治 疗。除此以外，有研究结果表示，12号密码子的突变使得甘氨酸突变为撷氨酸的K-ras基因 (G12V)与大肠癌病人总生存数下降相关，G12V突变体与联合其他突变体和野生型的K-ras 相比表现出明显的更差的总生存率，而除G12V以外的其他突变则观察到明显的对总生存 数有保护作用。大量的分析表明G12V突变增加了复发和死亡的风险。研究表明是由于G12V 与GTP紧密结合产生长期的有致癌潜能的信号所致，而G12D (甘氨酸突变为天冬氨酸）与 GTP的低亲和力使得G12D逃脱了致癌的GTP结合状态。综上所述检测K-ras基因突变的情 况不仅仅有助于肿瘤的早期诊断及预防，也有利于肿瘤患者的临床治疗。准确且迅速的诊 断出K-ras基因有无12、13号密码子突变对肿瘤的早期诊断及预后有着重要的意义。
[0020] 本发明还提供一种检测K-ras基因突变的试剂盒，包括AS-PCR引物、竞争阻断引 物、TaqMan探针、内控引物、内控探针、聚合酶、dNTP和缓冲液，其中，所述AS-PCR引物为针 对包含K-ras基因突变区域的靶序列设计而成，所述竞争阻断引物为针对AS-PCR引物设计 而成，并且所述竞争阻断引物为与AS-PCR引物反向互补的寡核苷酸。
[0021] 进一步的，所述AS-PCR引物为针对包含K-ras基因2号外显子的12密码子和/ 或13密码子突变的靶序列设计而成，其中，12密码子突变包括GGT>GAT突变、GGT>GCT突 变、GGT>GTT突变、GGT>AGT突变、GGT>CGT突变和GGT>TGT突变中的一种或几种，13密码子 突变包括GGOGAC突变。
[0022] 进一步的，
[0023] 1)根据KRAS基因2号外显子12密码子的GGT>GAT突变而设计的AS-PCR引物及 竞争阻断引物分别为包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3的AS-PCR引物和包含SEQ ID NO: 2 的竞争阻断引物；
[0024] 2)根据KRAS基因 2号外显子12密码子的GGT>GCT突变而设计的AS-PCR引物及竞 争阻断引物分别为包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 3的AS-PCR引物和包含SEQ ID NO: 10 的竞争阻断引物；
[0025] 3)根据KRAS基因 2号外显子12密码子的GGT>GTT突变而设计的AS-PCR引物及竞 争阻断引物分别为包含SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 3的AS-PCR引物和包含SEQ ID NO: 12 的竞争阻断引物；
[0026] 4)根据KRAS基因2号外显子12密码子的GGT>AGT突变而设计的AS-PCR引物及竞 争阻断引物分别为包含SEQ ID