一种鲑肾杆菌的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细菌检测领域，具体而言，涉及一种鲑肾杆菌的检测方法。
【背景技术】
[0002] 鲑肾杆菌（Renibacterium salmoninarum)是肾杆菌属的唯一成员，是一种细胞内 寄生菌。其具有以下形态：规则短杆菌，0.3?1.0 μ mX 1.0?1.5 μ m。成对，有时成短链。 细胞呈革兰氏阳性，没有荚膜，不运动，不生孢，好氧。
[0003] 鲑肾杆菌广泛分布在大量养殖鲑科鱼类及出产鲑科鱼类的国家和地区，如加拿 大、智利、英国、法国、德国、冰岛、意大利、日本、西班牙、美国和南斯拉夫等。在鱼类养殖产 业中，为了了解养殖鱼的生长状态，常需要对其进行不定期的定性检测。
[0004] 在相关技术中，该菌常见的检测方法为将供试样品在增菌培养基上培养预定时 间，然后通过观察菌落形态、生化鉴定以判定供试样品中是否含有该菌。
[0005] 然而由于鲑肾杆菌的生长条件苛刻，生长速度缓慢，而且后续分离培养的技术难 度很大，进而造成这种常规方法的检测结果不可信，存在准确度低的缺陷。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种鲑肾杆菌的检测方法，该检测方法具有。
[0008] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009] 本发明提供了一种鲑肾杆菌的检测方法，包括以下步骤：
[0010] 1)、取待检样品，并进行预处理；
[0011] 2)、对预处理后的样品进行细菌核酸提取，以提取到的核酸为模板，以P3和M21为 引物进行PCR扩增；
[0012] 3)、以步骤2)得到的扩增片段为模板，以P4和M38为引物进行PCR扩增；
[0013] 4)、将步骤2)和步骤3)得到的扩增片段分别进行琼脂糖凝胶电泳、回收以及测序 后分别与如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列进行同源性比对分析；
[0014] 其中，P3、M21、P4 和 M38 的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 所示。
[0015] 本发明提供的这种鲑肾杆菌的检测方法，其实现了鲑肾杆菌的分子检测，具体的， 以特定的引物P3和M21对从待检样品中提取的核酸进行初步扩增；若待检样品中含有鲑肾 杆菌，则经过PCR扩增的产物中含有鲑肾杆菌P57表面蛋白基因 DNA片段（可经过电泳初 步检测）。
[0016] 为了防止单一的PCR扩增易出现假阳性的结果，对第一次扩增后的片段以P4和 M38为引物再次进行PCR扩增；并将得到的产物进行电泳（若出现相应的特异性条带，则说 明该样品中含有鲑肾杆菌）。进一步的，为了确保使得检测结果的准确性；分别对两次PCR 扩增后的片段电泳检测后进行测序；并将其分别与鲑肾杆菌P57表面蛋白基因383bp的 〇嫩片段序列彼〇10勵：1)、鲑肾杆菌？57表面蛋白基因32(^的0嫩片段序列彼〇10 NO :2)进行同源性比对分析，通过判定待检样品中是否含有鲑肾杆菌P57表面蛋白基因，并 结合两次PCR的电泳结果可准确的获知该待检样品中是否含有鲑肾杆菌。
[0017] 可选的，在步骤1)中：
[0018] 所述预处理包括将待检样品研磨后并加入血清体积百分含量为8-12%的199细 胞培养液。
[0019] 可选的，在步骤1)中：
[0020] 所述待检样品取自待检个体的肝或肾。
[0021] 可选的，在步骤2)中：
[0022] 所述？0?扩增的反应体系为：模板8-12以1，10馳的(1阶131-3 4 1、100?111〇1/^1的 Ρ32-3μ 1，lOOpmol/μ 1 的Μ212-3μ l，25mM的MgCl29-ll μ 1，10XPCR buffer 8-12μ 1，5U/ μ I 的 Taq 酶 I μ 1，DEPC 水补齐至 100 μ 1。
[0023] 可选的，在步骤2)中：
[0024] 所述PCR扩增的反应的程序为：94°C预变性4-5min ;94°C变性28-32s，60°C退火 28-32s，72°C延伸 60-70s，共 30-35 个循环：
[0025] 可选的，在步骤3)中：
[0026] 所述PCR扩增的反应体系为：模板4-6μ l，10Mm的dNTPl-3y lUOOpmol/μ 1的 Ρ42-3μ 1，lOOpmol/μ 1 的Μ382-3μ l，25mM的MgCl29-ll μ 1，10XPCR buffer 8-12μ 1，5U/ μ 1 的 Taq 酶 1 μ 1，DEPC 水补齐至 100 μ 1。
[0027] 可选的，在步骤3)中：
[0028] 所述PCR扩增的反应的程序为：所述PCR扩增的反应的程序为：94°C预变性 4-5min ;94°C变性 28-32s，60°C退火 28-32s，72°C延伸 60-70s，共 30-35 个循环。
[0029] 可选的，在步骤4)中：
[0030] 若步骤2)得到的扩增片段在进行琼脂糖凝胶电泳时，有特异性条带，则在步骤3) 中，所述模板为将步骤2)中获得的扩增片段经过100-1000倍稀释后的片段。
[0031] 可选的，在步骤4)中：
[0032] 所述琼脂糖凝胶电泳中所用的琼脂糖凝胶的浓度为1-2%，且含有0. 4-0. 6μ g/ mL的EB ;所述琼脂糖凝胶电泳的电场强度为4-6V/cm，时间为0. 4-0. 6h。
[0033] 可选的，在步骤1)之前，还包括：
[0034] 对待检样品进行组织切片后革蓝氏染色，并于X1000的视野下进行镜检，观察所 述组织切片是否含有革兰氏阳性短杆菌。
[0035] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0036] (1)、对待检样品实现了鲑肾杆菌形态分子检测，通过组织印片及革蓝氏染色后镜 检初步进行判定，再利用设定的引物判定该通过初步判定的待检样品是否含有鲑肾杆菌 P57表面蛋白基因片段，方法简单易行，避免了不必要的浪费，克服了常规检测中由于鲑肾 杆菌生长条件苛刻，生长速度缓慢，后续分离培养的技术难度大等一系列问题导致的检测 结果不可信的缺陷。
[0037] (2)、对经过初步判定的待检样品进行了两次PCR扩增，克服了一次PCR检测易出 现假阳性的问题。
[0038] (3)、将待检样品组织印片染色后切片镜检、电泳分析以及扩增产物的序列比对进 行结合，确保了检测的准确性。
【附图说明】
[0039] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0040] 图1为本发明实施例1提供的鲑肾杆菌的检测方法的流程图。
【具体实施方式】
[0041] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注