一种检测貉源性物种成分的特异性引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测貉源性物种成分的特异性引物及其应用，属于动物源性成分 特异性检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 絡在动物分类学中属于哺乳纲、食肉目、犬科、絡属（Nyctereutes)，起源于中国的 东北部乌苏里江地带以及俄罗斯境内。最初驯化饲养的貉成为乌苏里貉，后培育出很多毛 色变种，如吉林白貉和红色貉等。我国开展毛皮动物相关饲养技术研宄始于上世纪50年 代，特种经济动物以其独特的资源特性、重要的经济价值和日益增长的市场需求而成为我 国农业的新兴特色产业。我国是特种经济动物饲养大国，貉年饲养量达3000万只。
[0003] 目前，食品安全问题引起了各国政府和消费者的高度关注，尤其是肉食品、动物饲 料安全性等关系人民健康、百姓切身利益的问题得到了广泛重视。疯牛病、禽流感、狂犬病、 犬瘟热等在世界各地的蔓延和传染给人类的事也有发生，目前畜禽肉食品的动物源性成分 的鉴别检测已涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。检验检疫部门对检 测高新技术进步的需求日益强烈，在饲料贸易、进出口防疫检查、肉制品消费市场监督等方 面表现尤为突出。貉是犬科动物，貉肉作为养殖业的附属品，常被用作饲料甚至做成肉制 品，如果未经过检验检疫程序，一旦携带致病因子，极大地危害了消费者的健康，扰乱了 畜产品及肉制品市场秩序。近年来，羊肉卷市场比较混乱，很多压制的羊肉卷中掺杂着貉 肉、狐狸肉、貉子肉以及其他肉类，从感官上难以去分辨，也曾有调查发现，貉肉有被冒充为 狗肉的现象，为了能快速、特异性检测出肉制品或者饲料中的貉的成分，有必要开发出一种 基于分子水平貉源性成分的检测方法，为检验检疫部门或者消费者提供便利的技术服务， 并且要求方法简便易于操作，检测成本低廉。
[0004] 目前，为了确定食物及饲料的真实成分，已经开发了很多种动物源性成分鉴别的 方法，有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。在分子生物学方法中，分子标记技术以其 快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨大的开发潜力和广阔的应用前景。在动植物源性成 分鉴别检测中应用的分子标记主要包括核DNA，RNA、线粒体DNA(mtDNA)、和蛋白质分子标 记等。PCR分子标记鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样 品要求较低，比如无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，或者经过一定压力、温 度加工后，只要能够提取基因组核酸，就都可以用于PCR反应。
[0005] 哺乳动物和禽类mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因 组小（约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基 因组（哺乳动物约1000- 2300个拷贝）等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜禽肉食品 及饲料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小（加工 过程中mtDNA保持较完整）、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA的PCR分子标记技术的上 述特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的前景。
[0006] 国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研宄报道，国内对牛、绵羊、猪、鸡、驴、 马、鹿属、狮、虎、豹等源性成分鉴定进行了研宄报道。在用分子生物学方法鉴定检测动物源 性成分的研宄上，对貉源性成分鉴别检测的研宄很少，张丽华等人利用酶切的方法研宄了 貂心线粒体mtDNA鉴定及特征分析，采用DNA限制性内切酶片段长度多态性（mtDNA-RFLP) 分析技术和聚合酶链反应（PCR)扩增细胞色素 b基因部分序列片段。结果表明新鲜的貂心 组织可提取完整的mtDNA，并能扩增出310bp大小的Cytb基因，与鸡心脏mtDNA限制性内 切酶酶切图谱有差异。RFLP方法所用的酶价格较贵，检测成本高。张洪海等人对鼬科动物 线粒体DNA控制区结构分析，但并未进一步做源性成分的检测。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种检测貉源性物种成分的特异性引物及其应 用，采取的技术方案如下：
[0008] 本发明的一个目的在于提供一种检测貉源性物种成分的特异性引物，该引物是以 貉属物种的线粒体全基因组序列为参考序列，筛选出貉线粒体基因组中进化速率较快的区 段，根据相应区段设计引物，最后对引物进行特异性验证后筛选出的引物。
[0009] 所述特异性引物是以GeneBank:NC-013700. 1区段为模板设计得到的特异性引 物。
[0010] 优选地，所述特异性引物的正向引物和反向引物的核苷酸序列如下：
[0011] 正向引物：5'-ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'
[0012] 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。
[0013] 所述特异性引物的引物目标扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0014] 所述特异性引物用于检测肉制品、饲料和毛皮产品中的貉源性物种成分。
[0015] 所述引物扩增的条件为：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，IOmin ;4°C保存反应产物。
[0016] 本发明的另一目的在于提供一种含有所述特异性引物的试剂盒，该试剂盒包括 10又？0?缓冲液、1〇11111〇1/1正向引物、1〇11111〇1/1反向引物、1〇11111〇1/1(1阶1 3和5"1^丁&9〇嫩 聚合酶。
[0017] 优选地，所述试剂盒包括10 X PCR缓冲液、lOumol/L正向引物、lOumol/L反向引 物、lOumol/L dNTP 和 5U/uL TaqDNA 聚合酶；
[0018] 其中，正向引物：5' -ATAGGTCTTCCAATCGCAGTA-3'
[0019] 反向引物：5' -GTGGGGTAACAGTCCGAGTA-3'。
[0020] 所述试剂盒用于检测肉制品、饲料和毛皮产品中的貉源性成分。
[0021] 所述引物扩增的条件为：预变性：94°C，3min ;进入循环：94°C变性30s，58°C退火 30s，72°C延伸30s，35次循环；终止延伸：72°C，IOmin ;4°C保存反应产物。
[0022] 所述特异性引物是通过分析比对了貉属动物线粒体全基因组序列，查找特异性位 点，旨在只针对貉特异性扩增，而对实验中涉及到的其他动物物种不能扩增。本发明开展的 试验初期设计了 4对引物，通过筛选条件从而确定第4对引物具有最好的貉属特异性。4对 引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 8所示。
[0023] 本发明着重从鉴定貉源性成分的角度出发，基于线粒体基因组序列设计引物，利 用电泳方法及核酸序列测定方法，结合序列比对，开发研制出一种分子水平上的检测试剂 盒，具有灵敏度高、特异性好、易操作等优点。
[0024] 本发明有益效果：具有物种特异性PCR方法的简单性、物种特异性和高度灵敏性， 该方法的使用极大地改善和方便了食物、饲料中动物源性成分的检测。与其他分子生物学 技术如序列分析、PCR-RFLP 或 RAPD(RandomAmplified Polymorphic DNA)相比，本发明更 加便宜、更加快速、更加适合于大多数样品的常规检测。
【附图说明】
[0025] 图1为特异性引物针对貉等不同物种基因组PCR扩增产物电泳图；
[0026] (M，Marker ;1，貉；2,蓝狐；3,银狐；4,貉子；5,猪；6,鸡；7,狗；8,羊）。
[0027] 图2为灵敏度检出限电泳图；
[0028] (M，Marker ;1，貉基因组原浓度；2-6,浓度依次为原浓度的50%，10%，1 %， 0· 5%，0· 1% ) 〇
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0030] 以下实施例所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试 剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获取。
[0031] 实施例1貉源性成分DNA的PCR检测试剂盒及检测方法的建立
[0032] 一、貉源性DNA的PCR检测引物的设计
[0033] 从GenBank检索到食肉目犬科、絡属动物线粒体序列相关信息，将序列进行blast 序列比对，根据已有的相近物种的线粒体全基因组序列，甄别物种保守区、分析特异性位 点，筛选适于设计貉特异性扩增引物的区段，从初步筛选的8个适宜区段中进一步分析，排 除易于引起引物二具体、退火温度不合适等因素，细化选择了 4个位点，作为貉特异性引物 设计的位点，而其他区段都不适合于设计貉特异性引物，该引物设计基于已经公开发表的 NCBI genbank的序列NC-013700. 1。利用引物设计软件primer5. 0设计出鉴别检测貉源性 成分的PCR特异性引物即只能扩增出貉DNA特