用于检测蓝舌病病毒的基因芯片及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及蓝舌病病毒的基因检测芯片及 其检测方法。
【背景技术】
[0002] 蓝舌病（Bluetongue disease, BT)是由蓝舌病毒（Bluetongue virus, BTV)引起 的急性、烈性非接触性虫媒传染病。BTV主要感染绵羊、山羊、牛等家养和野生反刍动物， 常见临床症状为高热、舌头变蓝和口腔粘膜水肿出血等。一般情况下，该病的死亡率为 20% -30%，但对于某些品种的绵羊，致死率可高达90%，严重影响畜牧业的发展。蓝舌病 病毒主要通过吸血昆虫（如库蠓等）吸吮带毒血液后叮咬易感动物进行传播，因此该病的 爆发流行具有一定的季节性、地方性和周期性。另外，该病毒也可通过精液和胎盘进行垂 直传播。蓝舌病是一种世界性危害的虫媒性传染病，OIE将其列为A类疫病，我国将其列为 一类动物疫病，主要分布于美洲、非洲、澳洲及亚洲地区，我国也在云南、湖北、安徽、四川、 山西、广西等多个地区分离得到BTV。近年来，随着全球气候变暖和国际动物贸易的逐年增 加，蓝舌病在全球范围内有扩大流行的趋势，可感染多种动物，对畜牧业生产发展和人类健 康构成严重威胁。
[0003] 蓝舌病病毒属于呼肠孤病毒科环状病毒属，病毒粒子呈二十面体对称，无囊膜， 由10个节段的双链RNA组成，编码7种结构蛋白和4种非结构蛋白，为迄今为止分子量最 大的RNA病毒。目前已证实BTV至少存在24个血清型，各血清型间交叉保护力低。另外， 蓝舌病病毒常与小反刍兽疫、水疱性口炎、猪水疱病毒等混合感染，大大增加对该病的诊断 难度。我国蓝舌病的诊断和检疫的标准（GB/T18636-2002)方法主要有病毒的分离鉴定、抗 原捕获ELISA(抗原捕获ELISA)、定型微量中和试验和空斑及空斑抑制定型试验等用于病 原的检测，琼脂免疫扩散试验（AGID)和竞争ELISA (C-ELISA)用于抗体的检测。病毒分离 鉴定是OIE推荐的诊断BTV的方法之一，但是该方法存在培养周期长的局限性。血清学检 测方法可用于病毒分离物的血清型鉴定，也可用于BTV特异性抗体的检测。BTV核酸检测技 术包括通用型检测和分型检测，主要包括核酸探针技术、RT-PCR、荧光定量PCR、基因芯片检 测技术等。蓝舌病尚无有效的治疗方法和疫苗，早发现、早处理依靠于快速、准确的检测手 段。因而能够准确快速检测出BTV，在动物及其副产品的进出口检疫中具有重要的意义。
[0004] 基因芯片（Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、 氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异 性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测 设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成病毒检测和基础研宄等方面的工 作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。因此，该技术被广泛应用 于诊断检测、差异表达分析、测序等诸多领域。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术中的不足，本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时 省力并且易于观察结果的微阵列芯片，检测蓝舌病病毒的基因芯片。
[0006] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于检测蓝舌病病毒的基因芯片包 括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH 20、检测芯片、芯片探针 的点样分布、芯片盖片、芯片围栏、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样 技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的醛基基片上，形成的微阵列。 微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：
[0007] 点样位置质控分区Pl，包含至少一个点样位置质控探针：SEQ ID NO. 2 ;
[0008] 杂交阳性质控分区P2,包含至少一个杂交阳性质控探针：SEQ ID NO. 3 ;
[0009] 杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；
[0010] 所述待测样品探针区包含至少一个蓝舌病病毒探针：SEQ ID NO. 1。
[0011] 利用上述基因芯片检测蓝舌病病毒的检测方法，具体步骤如下：
[0012] (1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待测组织或病毒 的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备cDNA，获得待检样品DNA ;
[0013] (2) PCR 扩增：25 μ L PCR 反应液包含：rTaq 酶 12.5 μ L、引物 Mix 5.4 μ L、待测样 品DNA 3 μ L、无核酸酶灭菌水4. 1 μ L ;
[0014] 其中，所述引物Mix含有：
[0015] 20 μ mol/L蓝舌病病毒特异上游引物SEQ ID NO. 4 0.2 μ L，
[0016] 20 μ mol/L蓝舌病病毒特异下游引物SEQ ID NO. 5 0. 2 μ L，
[0017] 20 μ mol/L PCR 通用上游引物 SEQ ID NO. 6 4 yL，
[0018] 20 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID NO. 7 I yL ;
[0019] 按如下步骤进行扩增：94°C 5min ;94°C 30sec，56°C 30sec，72°C 25sec 循环 12 次； 94°C 30sec，5(TC 30sec，72°C 25sec 循环 30 次；72°C IOmin ;
[0020] (3)杂交：首先配制杂交液：杂交缓冲液7. 9 μ L、PCR扩增产物7 μ L、杂交阳性对 照0. 1 μ L，混匀后95°C变性8min，冰上放置5min，然后采用15 μ L杂交液进行杂交；杂交 缓冲液每1000 μ L包括20 X SSC 500 μ L、10 % SDS 10 μ L及无核酸酶灭菌水490 μ L。
[0021] (4)结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说 明对照，判定结果。
[0022] 本发明综合基因芯片的优点，利用寡聚核苷酸探针的稳定性，建立一种快速、准确 鉴定蓝舌病病毒的基因芯片检测技术，为控制蓝舌病病毒的传播及进出境动物的检疫具有 重要作用。
[0023] (1)成功地构建了 BTV检测基因芯片：本发明所制备的蓝舌病病毒探针可与对应 病毒目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。
[0024] (2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、 灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。
[0025] (3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效 的手段，为今后出入境动物检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出境动物检疫 工作的需要，控制蓝舌病病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意 义。
【附图说明】
[0026] 图1芯片探针分布示意图；
[0027] 图2蓝舌病病毒杂交及特异性结果图；
[0028] 图3蓝舌病病毒基因芯片检测灵敏度结果图；
[0029] 图中：Pl-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；1- 口蹄疫病毒A型探针分 区；2- 口蹄疫病毒亚洲I型探针分区；3- 口蹄疫病毒通用型探针分区；4- 口蹄疫病毒O型 探针分区；5-水疱性口炎病毒探针分区；6-猪水疱病病毒探针分区；7-蓝舌病病毒探针分 区；8-小反刍兽疫病毒探针分区；N-杂交阴性质控分区；
[0030] 杂交说明：Pl :探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性；
[0031] P2 :杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性；
[0032] N :杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性；
[0033] 蓝舌病病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，7号探针 壳；
[0034] 图 3 中，A:2.99X 108copies/uL ;B:2.99X 107copies/uL ;C:2.99X 106copies/uL ; D:2. 99X 105copies/uL Ε:2· 99X 104copies/uL ;F:2. 99X 103copies/uL。
【具体实施方式】
[0035] 提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于以下 实施例。
[0036] 实施例1，本发明是基于对蓝舌病病毒的细胞增殖，提取病毒基因组。选取不同的 特异保守序列设计了 1条寡核苷酸探针，可与相应的病毒CDNA的PCR产物进行特异性结 合，PCR进行基因组扩增时，通用上游引物5'端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产 物在50°C下进行杂交。根据荧光信号位置、强度判断杂交结果，以此来检测蓝舌病病毒。根 据Genbank网站上公布的蓝舌病病毒基因序列利用Primer Premier 5.0生物软件设计PCR 引物 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 7。克隆基因序列，