在原核细胞周质中产生多肽的方法
【专利说明】在原核细胞周质中产生多肽的方法
[0001] 本文报道了在原核细胞中产生多肽的方法，其中使用存在螯合剂的缓冲系统中的 孵育步骤，在确定PH值和温度值下，从原核细胞周质中回收重组产生的多肽。
【背景技术】
[0002] 具有合适的信号序列时，重组产生的多肽可以被分泌到大肠杆菌细胞的周质间 隙中（J〇ly，J.C.和 Laird, M.W·，Periplasm 编著，Ehrmann，M. ,ASM 印制，Washington D. C.，（2007)345-360)。在化学氧化环境中二硫键形成，由此有利于多肽在功能上的正确折 叠。这些多肽从周质间隙中的选择性分离是所希望的，以避免来自大肠杆菌的宿主细胞蛋 白（HCP)的污染。由此，有利于随后的多肽纯化。
[0003] 示例性分离方法是如 Ren, G.等，J. of Bacteriology 189 (2007) 2777-2786 所描 述的渗压冲击。使用该方法，溶解于TRIS缓冲液（pH为7. 2)中的EDTA使原核细胞外膜去 稳定，这使得蔗糖渗透到周质间隙。蔗糖是不能透过内膜的。之后通过离心除去TRIS-EDTA 缓冲液中，将细胞迅速重悬于冰冷的蒸馏水中。由此水浸入充满蔗糖的周质间隙，通过周质 体积的增加使不稳定的外膜崩解。添加氯化镁重新稳定外膜。
[0004] 可以在 Humphreys, D. P. (The Periplasm(编著）Ehrmann，M.，第 361-388 页，Washington, D.C. :ASM 印制（2007))和 Middelberg，A. P. (Biotechnol. Adv. 13(1995)491-551)中找到其他方法。
[0005] 根据Joly和LaircK见上文），"当培养体积达到或高于10升时，以小规模分离周 质级分（fraction)的常规方法（如原生质体或渗压冲击处理）实际上不能完成"。"从外 部介质回收蛋白或在仅破坏外膜和肽聚糖后回收蛋白仍然是尚未在大规模上付诸实践的 一个目标"（第354页）。
[0006] 在W02012/013930中报道了，从表达重组蛋白和二硫化物异构酶DsbC的革兰氏阴 性细菌宿主细胞的样品或提取物纯化重组蛋白，包括调节样品或提取物的PH值以沉淀和 分离DsbC。在W001/94585中报道了特异于人肿瘤坏死因子（TNF)-a的新型抗体对于治 疗TNF-α介导的疾病是有用的，例如，充血性心力衰竭、败血症或内毒素性休克、恶病质和 成人呼吸窘迫综合症。在美国2005/048056中报道了制备具有重链和轻链的肿瘤坏死因 子-α抗体，包括发酵细胞混合物、形成细胞沉淀、并允许沉淀持续放置一段时间。
[0007] 在WO 2007/106120中报道了调节肽分子组织，分布包括向组织施用包含血清白 蛋白结合肽的缀合物分子。在W001/45746中报道了对免疫球蛋白（Ig)G、IgM和/或人血清 白蛋白具有亲和性的肽配体可被缀合，并用于延长活性剂从循环中清除的半衰期。在美国 2004/001827中报道了调节肽分子的组织分布，用于增强治疗功效并减少副作用，其包括向 组织施用包含肽的配体结构域和活性结构域的缀合物分子。
【发明内容】
[0008] 在本发明中已经发现，通过在室温下使细胞接触pH值约为8的含有缓冲剂（如 Tris)和螯合剂（如EDTA)的溶液、或孵育细胞与pH值约为8的含有缓冲剂（如Tris)和 螯合剂（如EDTA)的溶液，可以从原核细胞的周质中分离重组产生的多肽。该方法能够在 大规模生产过程中以高产率和纯度分离重组产生的多肽。分离的多肽对下游处理（例如纯 化）显示出良好的可行性。
[0009] 如本文中所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，所述方法包括在溶液中孵育 原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约IOmM至约95mM的缓冲剂和约0. 5mM 至约9. 5mM的螯合剂，所述溶液的pH值约7至约10。
[0010] 在一个实施方案中，螯合剂选自乙二胺、次氮基三乙酸（NTA)、乙二醇四乙酸 (EGTA)、二亚乙基三胺五乙酸（DTPA)、1，2-双（邻-氨基苯氧基）乙烷-N，N，N'，N'_四乙酸 (BAPTA)、乙二胺-N，Ν' -二琥珀酸（EDDS)、膦酸盐（如乙二胺四（亚甲基膦酸）EDTMP或二 亚乙基五（亚甲基膦酸）DTPMP)、柠檬酸、卩卜啉类化合物（如血红素、叶绿素或维生素 Β12)。 在一个实施方案中，螯合剂是乙二胺四乙酸（EDTA)。
[0011] 如本文所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，所述方法包括在约25°C在溶液 中孵育（重悬）原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约IOmM至约95mM的 Tris-HCl和约2mM至约6mM的EDTA，所述溶液的pH值约7至约10。
[0012] 如本文所报道的一个方面是用于产生多肽的方法，所述方法包括在约25°C在溶液 中孵育（重悬）原核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约IOmM至约95mM的 Tris-HCl和约2mM至约4mM的EDTA，所述溶液的pH值约7至约10。
[0013] 在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约ImM至约6mM。在一个实施方案中，螯合剂 的浓度为约ImM至约4mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约ImM至约3mM。在一个实 施方案中，螯合剂的浓度为约2mM至约6mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约2mM至 约4mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约2mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为 约4mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度为约6mM。
[0014] 在一个实施方案中，EDTA的浓度为约0. 5mM至9. 5mM。在一个实施方案中，EDTA 的浓度为约ImM至约3mM。在一个实施方案中，EDTA的浓度为约2mM。在一个实施方案中， EDTA的浓度为约4mM。在一个实施方案中，EDTA的浓度为约6mM。
[0015] 在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约2mM。
[0016] 在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约4mM。
[0017] 在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于，所述EDTA的浓度为约6mM。
[0018] 在一个实施方案中，溶液具有约7. 5至约8. 5的pH值。在一个实施例中，本发明 所报道的方法的特征在于，PH值约为8。
[0019] 在一个实施方案中，孵育时间为约20分钟至约3. 5小时。在一个实施例中，本发 明所报道的方法的特征在于，孵育时间是约30分钟。
[0020] 在一个实施方案中，缓冲剂是与原核细胞外膜相互作用的物质。
[0021] 在一个实施方案中，缓冲剂是一价有机胺。在一个实施方案中，缓冲剂是三（羟甲 基）氨基甲烷（Tris)或其盐。
[0022] 在一个实施方案中，缓冲剂选自磷酸或其盐、吗啉或其盐（MOPS)、3_{[三（羟甲 基）甲基]氨基}丙磺酸（TAPS)、N，N-双（2-羟乙基）甘氨酸（Bicine)、N-三（羟甲基） 甲基甘氨酸（Tricine)、3-[N-三（羟甲基）甲基氨基]-2-羟基丙磺酸（TAPSO)、4-2_羟乙 基-1-哌嗪乙磺酸（HEPES)、2-{[三（羟甲基）甲基]氨基}乙磺酸（TES)、组氨酸或其盐、甘 氨酸或其盐，或三（羟甲基）氨基甲烷（Tris)或其盐。在一个实施方案中，盐是Tris-HCl。
[0023] 在一个实施方案中，Tris-HCl的浓度为约IOmM至约95mM。在一个实施方案中， Tris-HCl的浓度为约15mM至约50mM。在一个实施方案中，Tris-HCl的浓度为约20mM至 约60mM。在一个实施例中，本发明所报道的方法的特征在于！Tris-HCl的浓度为约20mM。 在一个实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于：Tris-HCl的浓度为约40mM。在一个 实施方案中，本发明所报道的方法的特征在于：Tris-HCl的浓度为约60mM。
[0024] 在一个实施方案中，在室温下进行该方法。在一个实施方案中，在20°C至33°C下 进行如本文所报道的方法。在一个实施方案中，在约25°C下进行如本文所报道的方法。
[0025] 在一个实施方案中，用于产生多肽的方法包括在约25°C在溶液中孵育（重悬）原 核细胞约15分钟至约6小时的步骤，所述溶液包含约IOmM至约95mM的Tris-HCl和约2mM 的EDTA，所述溶液的pH值约7至约10。
[0026] 在一个实施例中，本发明所报道的方法的特征在于，所述原核细胞是革兰氏阴性 细胞。
[0027] 在一个实施方案中，所述原核细胞是重悬细胞。
[0028] 在一个实施方案中，所述原核细胞选自具有外膜的革兰氏阴性细菌。在一个 实施方案中，所述原核细胞选自醋杆菌属（Acetobacter)、拟杆菌属（Bacteroides)、 疏螺旋体（Borrelia)、Bortadella、伯克霍尔德杆菌属（Burkholderia)、弯曲杆菌 属（Campylobacter)、衣原体属（Chlamydia)、梓檬酸细菌属（Citrobacter)、肠杆菌 属（Enterobacter)、埃希氏菌属（Escherichia)、梭杆菌属（Fusobacterium)、幽门螺 杆菌属（Helicobacter)、嗜血杆菌属（Hemophilus)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、军团 菌属（Legionella)、钩端螺旋体属（Leptospiria)、奈瑟氏球菌属（Neisseria)、硝化 杆菌属（Nitrobacter)、变形菌属（Proteus)、假单胞杆菌属（Pseudomonas)、立克次氏 体属（Rickettsia)、沙门氏菌属（Salmonella)、沙雷氏菌属（Serratia)、志贺氏菌属 (Shigella)、硫杆菌属（Thiobacter)、密螺旋体属（Treponema)、弧菌属（Vibrio)、黄单胞 菌属（Xanthomonas)或耶尔森氏菌属（Yersinia)。在一个实施例中，本发明所报道的方法 的特征在于，所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
[0029] 在一个实施方案中，多肽是非糖基化多肽。
[0030] 在一个实施方案中，多肽是抗体或抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段选自 Fv、Fab、Fab'、Fab' _SH、F(ab'）2;双抗体；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv);和由抗体 片段形成的多特异性抗体。
[0031] 在一个实施例中，本发明所报道的方法中使用的溶液基本上不含肽聚糖水解酶。 在一个实施方案中，肽聚糖水解酶选自溶菌酶（胞壁酸酶）、裂解的转糖基酶、N-乙酰 基-β -D-氨基葡萄糖苷酶、N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶或