氧合物的方法
【专利说明】通过使用高氧化态硫发酵而制备C2氧合物的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及通过使用嗜一氧化碳微生物厌氧发酵而由一氧化碳和/或二氧化碳 和氢气的基质制备乙醇和/或乙酸盐的方法。更特别地，本发明涉及以更划算且对该乙醇 和乙酸盐的制备有利的方式使用具体无机硫来源提供微生物的生物硫需求。
[0002] 置量
[0003] 用作液体发动机燃料或者用于与常规汽油或柴油发动机燃料混合的生物燃料生 产在世界范围内日益提高。这类生物燃料包括例如乙醇和正丁醇。关于生物燃料的主要驱 动之一是它们通过发酵和生物加工技术由可再生资源得到。惯例地，生物燃料由容易发酵 的碳水化合物如糖和淀粉制备。由于这些进料来源与人类食品供应竞争，许多近期的工作 关注生物燃料和其它化学品的替代进料来源。
[0004] -个替代进料来源为木素纤维素原料，例如林业废物、种植园树木、稻草、禾草和 其它农业废物。然而，木素纤维素材料的能使它们提供植物和树木的机械支撑结构的非常 不均匀性质使得它们固有地对抗生物转化。另外，这些材料主要包含三个分开类别的组分 作为结构单元：纤维素（Cjg聚合物）、半纤维素（各种C 5和C 6糖聚合物）和木质素（芳 族和醚连接的杂聚合物）。然后其它已知的技术可将木素纤维素生物质进料转化成合成气 (也称为合成气体，主要是〇)、4和CO 2与其它组分如CH4、N2、NH3、H 2S和其它痕量气体的混 合料）。然后将该合成气用厌氧微生物发酵以产生生物燃料如乙醇、正丁醇或化学品如乙 酸、丁酸等。美国专利7, 285, 402公开了通过使用厌氧细菌发酵而将一氧化碳、二氧化碳和 氢气转化成乙酸和乙醇的方法，通过引用将其教导并入本文中。
[0005] 用于生产生物燃料和其它化学品的厌氧发酵可使用由多种来源提供一氧化碳和/ 或二氧化碳和氢气的任何气体基质。例如，美国专利公开2011/0300593公开了来源如钢厂 废气作为一氧化碳的来源并通过引用将其教导并入本文中。许多其它基质来源是可得到 的。例如，合成气可由许多其它含碳原料如天然气、重整气体、泥煤、石油焦、煤、固体废物和 填埋气体制备。
[0006] 乙醇可使用多种厌氧细菌，特别是例如来自梭菌的那些由C0、0)2和H2制备。例 如，描述了由气体制备乙醇的多种细菌菌株，包括杨氏梭菌（Clostridium Ljungdahlii)、 Clostridium autoethanogenum 和 Clostridium coskatii，这些都描述于本文中。
[0007] 通过厌氧微生物制备乙醇和其它产物受发酵区内的许多操作条件影响（参见美 国专利 Nos. 5, 173, 429、5, 593, 886 和 6, 368, 819、WO 98/00558 和 WO 02/08438)。影响微 生物性能的两个主要条件是发酵区的pH和氧化还原电位（ORP)。W02009/022925公开了 pH 和ORP在气体基质转化成产物中的影响。
[0008] 用于代谢方法中的微生物需要营养素和微量营养素，且特定营养素供应可对微生 物的生长和持续性具有深远影响。事实上，可能需要这些营养素以使微生物使用一氧化碳 作为其能量来源。例如，微生物可能需要金属辅因子的存在以用于一氧化碳脱氢酶（CODH) 和乙酰-CoA合酶（ACS)的代谢作用。重要的是所有所要求的营养素以合适的量和生物可 用形式提供。
[0009] 另一所要求的营养素是还原硫来源，其通常为有机硫化物如半胱氨酸的形式。半 胱氨酸提供支持微生物培养物中发生的酶方法所需的硫来源。熟知微生物在其酶方法中需 要硫。事实上，电子传递介质，铁氧化还原蛋白以及Wood-Ljungdahl途径酶乙酰-CoA合酶 和一氧化碳脱氢酶包含硫。因此，重要的是以生物可用形式并以足够的供应加入硫以避免 微生物抑制产物的生长和制备。
[0010] 作为半胱氨酸的替代物，发现硫化氢在许多情况下是微生物代谢方法中所需的还 原硫来源。硫来源如硫化物与典型发酵介质中的硫化氢平衡存在。尽管硫化氢比半胱氨 酸更便宜，它是有毒的，因此需要特殊处理，并且以纯形式是特别危险的。提供硫化物盐形 式的硫如硫化钠仍产生发酵罐中可能由于蒸发而随时间而降低的硫化氢浓度。此外，硫化 氢在介质中具有有限的溶解度。硫化氢可在发酵区中可能需要的某些条件下变成高挥发性 的，由此恶化它作为硫来源的用途。由于硫化氢在水中的有限溶解度，溶液中的硫浓度可能 由于发酵介质内的条件而明显降低。因此，确定使用一氧化碳或氢气和二氧化碳气体作为 原料的发酵系统中所需醇生产中的微生物的改进或可选硫来源会帮助实现高醇生产率和 低方法操作成本。
[0011] 因此，由厌氧发酵制备乙醇或乙酸盐的方法获益于硫化物的发现，所述硫化合物 可便宜地提供在有利发酵条件下的微生物的生物硫需求，同时还消除了硫化氢作为硫来源 的缺点。
[0012] 美国专利公开20110300593公开了可选硫来源的使用。该文件仅明确地描述了聚 硫化物、多种聚硫化物、元素硫和胶态硫作为无机硫化合物以用作可选硫来源。更重要的 是，该文件描述了这些具体硫化合物作为提供硫化氢作为发酵介质中的活性物种的用途。 因此，该参考文献没有确定除硫化氢外，会提供生物可用形式的硫的硫添加剂，因此没有克 服硫化氢的高挥发性问题。
[0013] 寻求增强合成气发酵制备C2含氧有机化合物的经济性的方法，其中硫营养素可通 过该方法以"按需"速率有效且便宜地提供。
[0014] 发明概沐
[0015] 本发明提供将合成气生物转化成C2含氧有机化合物如乙醇和乙酸盐的方法，其中 硫营养素的供应由硫添加剂提供，所述硫添加剂以满足微生物的代谢需求的形式为液体营 养介质贡献硫含氧阴离子或氢硫含氧阴离子，同时促进发酵区在会抑制污染微生物生长的 PH下操作。令人惊讶地发现这类化合物可提供由COXOdPH2基质制备乙醇和乙酸盐中嗜 一氧化碳微生物的营养硫需求。这类化合物包括在各种食品中例行地用作抗微生物剂的亚 硫酸氢盐。技术人员预期这类化合物干扰微生物的生长和生存能力。因此，惊讶地发现这 类化合物可有利地用于提供硫物种，所述硫物种会满足微生物的代谢要求，同时避免硫化 氢在发酵区中的较低pH条件下的挥发性问题。
[0016] 以宽方面，本发明提供使用产乙醇嗜一氧化碳微生物，同时将硫以生物可用且非 常可溶的形式供入发酵介质中而制备C 2氧合物的方法。保持5. 3以下，更优选5. 1以下的 PH在抑制发酵区中的污染微生物生长中是非常有利的。可改变或破坏发酵方法的常见污染 物是产生丁酸酯并可降低该方法对于更想要的乙醇产物的选择性的微生物。
[0017] 在提供较高氧化态硫中，本发明使用微生物作为将硫的氧化态降至可用形式的手 段。提出以该方式，微生物产生氢硫化物（HS-)，如果使用它的话，它在细胞内同化。这减 少了液体营养介质中HS -的存在，并帮助使会贡献于来自发酵的硫化氢排放的任何硫化 氢平衡浓度最小化。
[0018] 在特定实施方案中，本发明为通过用产乙醇嗜一氧化碳微生物厌氧发酵而制备 C2氧合物的方法。该方法包括：提供包含S(II)-S(IV)无机硫化合物的硫添加剂，其在含 水发酵介质中产生包含氧和/或氧和氢原子的硫阴离子，使微生物的微生物培养物与包 含一氧化碳的基质接触，将微生物培养物保持在包含硫添加剂且具有小于5. 3的pH的发 酵介质中，和从发酵介质中回收一种或多种C2氧合物。在另一实施方案中，硫添加剂包含 S(III)-S(IV)无机硫化合物。
[0019] 在一个特定实施方案中，硫添加剂为亚硫酸、亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢盐、连二亚 硫酸盐、硫代硫酸盐或其组合。在一个优选实施方案中，硫添加剂为亚硫酸、亚硫酸氢盐、偏 亚硫酸氢盐或其组合。在其它实施方案中，硫添加剂可包含亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠。
[0020] 在一个特定实施方案中，硫添加剂以至少0. 1，通常0. 1-10,优选0. 5-2毫摩尔硫 每克微生物干细胞重量的浓度存在于发酵介质中。
[0021] 在一个特定实施方案中，微生物与硫添加剂的接触在加入的有机硫来源的存在下 进行，且发酵介质中有机硫的浓度随着时间而降低。在一个优选实施方案中，发酵介质中有 机硫的浓度小于〇. 3毫摩尔有机硫每克微生物干细胞重量，更优选小于0. 1毫摩尔有机硫 每克微生物干细胞重量。
[0022] 另一方面，本发明提供消除半胱氨酸作为氨基酸和硫来源加入发酵的液体营养介 质中的方法。在本发明的一个特定实施方案中，发酵介质中的半胱氨酸浓度可明显降低，优 选降至小于0. 3毫摩尔每克微生物干细胞重量的浓度。在一个特定实施方案中，可完全消 除向发酵介质中的半胱氨酸添加。
[0023] 在本发明的另一方面，将发酵介质的pH保持为4. 3-5. 1，优选4. 9以下。
[0024] 在本发明另一方面，该方法包括在发酵介质中的螯合剂。在一个优选实施方案中， 本发明使用乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、氨三乙酸、柠檬酸钠及其混合物作为螯合 剂。
[0025] -般而言，乙醇是通过微生物制备的优选代谢物。在多数情况下，其它代谢物会与 乙酸盐一起在基质的发酵中产生。发现本发明方法可改进醇：酸产物比。发现大于5:1和 大于10:1的乙醇：乙酸盐产物比以及20:1或者与乙酸盐相比更有利于醇的较高比。
[0026] 本发明的一个应用是其中有机硫来源如半胱氨酸用于第一容器中以使微生物培 养物生长，然后将微生物培养物转移至第二容器中的情况。如果需要的话，第一容器还可包 含硫添加剂。来自第一容器的微生物培养物与基质的接触然后可在分开的第二容器中进 行。第二容器可以用很少或者不用半胱氨酸保持发酵。在本发明的特定实施方案中，第二发 酵容器是更大体积的发酵容器，如在种子培养操作中所实践的，以使微生物培养物传代至 商业规模体积。微生物培养物的这一转移可继续至第三发酵区以及具有更高体积的其它发 酵区中。在一个优选实施方案中，当发酵区体积提高时，有机硫如半胱氨酸的浓度会降低。 在另一实施方案中，将半胱氨酸加入发酵区中仅在具有小于40, 000升，更优选小于4, 000 升的体积的发酵区中继续。
[0027] 因此，在另一实施方案中，本发明为在通过厌氧发酵制备乙醇或乙酸盐中减少半 胱氨酸的方法。该方法包括：使嗜一氧化碳微生物的微生物培养物与包含一氧化碳的基质 接触并使微生