用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法
【专利说明】用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白 的方法
[0001] 本发明是关于一种用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的方法，以及更特别 地是关于一种间接酶促方法，用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性。
[0002] 发明的技术领域
[0003] 去纤维蛋白多核苷酸（Merck Index, 1996, no. 2915)是天然起源的物质，其是从 动物器官提取而得，且其是由低分子量的聚脱氧核糖核苷酸钠盐组成。去纤维蛋白多核苷 酸已成为许多医药研究的主题，所述研究已推测其可作为抗凝血剂用于治疗（美国专利号 3, 829, 567)。
[0004] 此外，去纤维蛋白多核苷酸亦已被成功用于治疗外周动脉血管疾病、急性肾功能 不全（美国专利号4, 694, 134)或急性心肌缺血（美国专利号第4, 693, 995)。
[0005] 目前，去纤维蛋白多核苷酸正用于进行静脉阻塞疾病（VOD)的治疗与预防的临床 试验。
[0006] 如同其他提取而得的生物物质，去纤维蛋白多核苷酸也受制于组成的有限变化 性，这对于天然生物聚合物是典型的。此状况的经典例子是肝素，已知其在链长、分子量、组 成、硫酸盐化的程度等方面随批次的变化性。此结果是相同重量的去纤维蛋白多核苷酸可 能实际上从比生物活性的观点而言是非等同的。
[0007] 由于其固有的生物聚合物本质，提取、分离与纯化的过程无法本身确保产物的绝 对的再现性。
[0008] 然而，如果控制良好，可能降低此变化性。为达此目的，已有研究得到用于通过从 器官提取分离去纤维蛋白多核苷酸的标准化的工业过程，例如美国专利号4, 985, 552所描 述的。
[0009] 上述过程所得到的产物通过测定一些特定的物理化学参数而表征，例如，电泳移 动率、消光系数、旋光力以及质量平均相对分子质量。然而，这些参数基本上取决于去纤维 蛋白多核苷酸的结构，并且无法提供其生物活性的信息。
[0010] 目前如我们所知，已报导用于评估去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的方法仅有 纤维蛋白平板测试法与优球蛋白水解时间凝血弹性图式记录（thromboelastographic recording)(Prino G. > Mantovani Μ. > Niada R. 、 Coccheri S. 、 Butti A. 、 Indagini preliminari sull' attivitdifibrinolitica、nell' animale e nell' uomo 与 di una nuova sostanza发表的 diversi organi animali, Simposio Internazionale:La ricerca scientifica nell' industria farmaceutica,意大利，罗马，1975 年 10 月 2-4 日一Il Farmaco, Ed. Prat.) (1969),24, 552-561)，以及美国专利号7,338,777公开的以血纤维蛋 白溶酶为基础的方法，上述皆通过引用并入本案。
[0011] 然而，在上述方法中，优球蛋白水解时间凝血弹性图式记录的特征是相当大的实 验复杂性、不令人满意的再现性与精准性，以及，在凝血弹性图式记录的一些特定例子中， 反应线性受限于非常严格的浓度范围。
[0012] 关于血纤维蛋白溶酶为基础的方法，通常通过体外测试中的多种标准而测定 血纤维蛋白溶酶的酶促活性。最常使用的方法之一是由分光光度法或荧光测定法测定 发色或发荧光化合物，所述化合物是通过血纤维蛋白溶酶作用于合适的底物上而释放 (Haemostasis, (1978)，7, 138-145)。通常使用具有SA1-A2-A3-X 的肽底物，其中八1与 A 2是 主要为非极性的氨基酸，A3是赖氨酸或精氨酸，以及X代表可测量的游离的化合物，例如对 硝基苯胺（PNa)或2-萘胺（NA) (Haemostasis，（1978)，7, 146-149)。除了上述肽底物之外， 已成功使用其他的、较简单的化合物，例如P-硝基节基对甲苯磺酰-L-精氨酸（Haemostas is, (1978)，7, 105-108)。
[0013] 该化合物X释放至孵育基质中的速率是与样品中存在的血纤维蛋白溶酶活性（单 位/毫克）成比例。美国专利号7, 338, 777公开的方法因此是基于上述血纤维蛋白溶酶评 估测试法中的发现，去纤维蛋白多核苷酸增加化合物X的释放速率与其浓度成比例。
[0014] 然而，此方法是在TRIS缓冲液进行，不需要任何其他的血浆/血清活化物/抑制 物。因此，该程序不会反应出生理条件或是恰当模拟去纤维蛋白多核苷酸在体内的作用机 制。
[0015] 因此，至今未有真正有效地、精确地且可再现的方法被描述并且验证用于测量去 纤维蛋白多核苷酸的生物活性，而精确地反映出产物在复杂生物系统（体内）中的作用机 制。。
[0016] 我们已经建立简单与可靠的方法用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性，使得 通过提取得到的样品受到控制，且因而使得以去纤维蛋白多核苷酸为基础的药物制备能够 被标准化。
[0017] 本发明的方法可测定去纤维蛋白多核苷酸的比生物活性，与参考标准比较，具有 高度的精准性与正确性。
[0018] 附图简述
[0019] 图1是通过以去纤维蛋白多核苷酸（浓度为0-50 μ g/ml，0-100分钟）活化或非 活化的哺乳动物的优球蛋白级分，显示PNA自底物S-2251的释放动力学的曲线图。
[0020] 图2是说明关于去纤维蛋白多核苷酸的标准品与测试样品的上升的S形曲线图。
[0021] 图3是显示标准制剂（例如：Sl_Ca，Sl_Cb，Sl_Cc)的"吸光度与时间的对应图"， 其鉴定合适的线性范围（例如：从30至35分钟）。
【发明内容】
[0022] 本发明因此涉及用于测定去纤维蛋白多核苷酸样品的比生物活性的方法，该方法 包含以下步骤：
[0023] a)使优球蛋白及血纤维蛋白溶酶特异性的底物接触去纤维蛋白多核苷酸，该底物 通过与该血纤维蛋白溶酶反应而提供可测量的产物；以及
[0024] b)测量在连续时间所形成的产物的量。
[0025] 本发明是一种间接的体外方法，用于测定去纤维蛋白多核苷酸的活性，其以去纤 维蛋白多核苷酸与优球蛋白之间的功能性相互作用为基础。
[0026] 优球蛋白是血清球蛋白的级分，其无法溶于蒸馏水中，但可溶于盐溶液中。
[0027] 优球蛋白包含纤维蛋白原、PAI-1、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂（tPA)、血纤维蛋 白溶酶原、以及少量的α 2-抗血纤维蛋白溶酶和因子VIII。
[0028] 本发明人惊讶地发现去纤维蛋白多核苷酸催化血纤维蛋白溶酶原水解为血纤维 蛋白溶酶。因此，当去纤维蛋白多核苷酸与优球蛋白及血纤维蛋白溶酶特异性的底物（例 如式A1-A2-A3-X的肽，如Haemostasis, (1978)，7, 138-149公开的，通过引用并入本文）孵 育时，该化合物X释放至孵育基质的速率增加与去纤维蛋白多核苷酸本身的浓度成比例。 [0029] 换言之，去纤维蛋白多核苷酸催化优球蛋白中所含的血纤维蛋白溶酶原水解为血 纤维蛋白溶酶；所述血纤维蛋白溶酶与血纤维蛋白溶酶特异性的底物，优选发色底物酶促 反应，以提供可测量的产物。
[0030] 本发明的方法因此还包括步骤：c)在去纤维蛋白多核苷酸的标准样品与测试样 品二者的酶促反应过程中，测定该可测量的产物的释放速率；d)数学上地及/或图形上地 关联该释放速率与所对应的去纤维蛋白多核苷酸浓度，以得到该去纤维蛋白多核苷酸的测 试样品的生物活性。
[0031] 本发明中用于测定的去纤维蛋白多核苷酸样