一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因 和应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一。我国是世界上最大的水稻生产和消费国。 近些年来，水稻总产保持在1. 9-2. 0亿吨，种植面积维持在0. 30-0. 32亿公顷，总产量与播 种面积均居世界前列，在国民经济中具有十分重要的意义。淀粉占稻米干重90%左右，居所 有粮食作物之首。作为我国传统主食，稻米淀粉的性质决定了稻米的食用、加工以及其适用 性。因此对其合成加工途径的深入研究，将有助于我们通过基因工程的手段对稻米进行品 质改良。
[0003] 种子的形成过程是贮藏淀粉在造粉体（特殊的质体）内经过一系列淀粉合成酶催 化加工形成可见淀粉颗粒的过程，同时伴随着胚乳细胞内造粉体和淀粉粒的增殖和发育。 在此过程中，种子逐渐膨大成熟，最后随着膜结构的降解整个胚乳内充满了排列整齐的淀 粉颗粒，可见这是一个复杂精细的生物学过程。
[0004] 水稻胚乳突变体按胚乳的成分可分为：胚乳淀粉突变体、胚乳蛋白质突变体、胚乳 微营养突变体。目前水稻中已经克隆出大量控制胚乳淀粉突变体的基因，这些基因大部分 是直接参与淀粉合成过程中的合成酶，另一些则通过其它途径间接参与淀粉合成，因此水 稻胚乳淀粉突变体，是用来研究水稻胚乳淀粉合成途径机理的理想材料。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供与水稻胚乳造粉体发育相关的蛋白及其编码基因与应用。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0007] 水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FL07,其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 序列表中的SEQ ID NO. 1由364个氨基酸残基组成，自氨基末端第70至355位为DUF1338 结构域。
[0008] 编码所述的水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FL07的基因。
[0009] 所述的编码水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FL07的基因，⑶S序列优选如SEQ ID NO. 1所示，由1092个核苷酸组成，全长序列优选如SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
[0011] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
[0012] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆 贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0013] 使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因 构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可 以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证 整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也 可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0014] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0015] 所述重组表达载体优选在pCAMBIA2300-Actinl载体的多克隆位点Smal之间重 组插入所述基因（FL07)得到的重组质粒pCAMBIA2300-FL07 ;所述pCAMBIA2300-FL07是将 由FL07cDNA片段通过重组技术插入到pCAMBIA2300-Actinl多克隆位点Smal之间得到的 (Clontech公司，Infusion重组试剂盒）。
[0016] 含有以上任一所述基因（FL07)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明 的保护范围。
[0017] 扩增所述基因（FL07)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0018] 一种培育造粉体发育正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入造粉体发育异 常的植物中，得到造粉体发育正常的转基因植物；所述造粉体发育异常植物为胚乳外周造 粉体碎裂的植物；所述造粉体发育正常的转基因植物为胚乳外周恢复透明，造粉体形态正 常的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入造粉体发育异常植物中； 所述造粉体发育异常植物可为fl 〇7。
[0019] 所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述 方法均可应用于水稻育种。
[0020] 利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导 入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti 质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方 法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单 子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨 树、草坪草、苜宿等。
[0021] 有益效果：
[0022] 本发明的造粉体发育相关蛋白影响水稻胚乳中造粉体形成过程。将所述蛋白的编 码基因导如造粉体发育异常的植物中，可以得到造粉体发育正常的转基因植物。所述蛋白 及其编码基因可以应用于谷物品质的遗传改良。
【附图说明】
[0023] 图1为野生型日本晴和突变体flo7的籽粒以及扫描电镜观察。
[0024] 图2为野生型日本晴和突变体fl〇7前期胚乳造粉体形态观察。
[0025] 图3为野生型日本晴和突变体fl〇7后期胚乳造粉体形态观察。
[0026] 图4为转基因植株分子水平检测结果。
[0027]图 5 为转 pCAMBIA2300-FL07 的 籽粒表型。
[0028] 图6为突变体和转pCAMBIA2300-FL07的籽粒的扫描电镜。
【具体实施方式】
[0029] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0030] 实施例1、植物造粉体发育相关蛋白及其编码基因的发现
[0031] 一、水稻粉质选突变体fl〇7表型分析
[0032] 在日本晴突变体库中筛选出籽粒粉质表型的株系fl〇7。
[0033] 与野生型比较，fl〇7的主要特征是籽粒胚乳外围粉质，不透明，扫描电镜分析证 实，fl〇7胚乳外围淀粉颗粒松散，透明部位正常（见图1)。通过透射电镜对胚乳发育前期造 粉体的观察结果显示，野生型中造粉体上的淀粉颗粒不断吸收营养变大，最后充满造粉体， 而突变体fl 〇7中造粉体中的淀粉颗粒不能紧密聚集，造粉体填充速率降低（见图2)。半薄 切片观察结果表明野生型种子外周的胚乳细胞中淀粉