重组蛋白质的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白纯化领域，更具体地，本发明涉及一种重组蛋白的纯化方法。
【背景技术】
[0002] 离子交换层析是一种常用于蛋白质纯化的层析技术。在离子交换层析中，如果周 围缓冲液的离子强度足够低，溶质表面的带电部分就被结合在层析基质上的相反电荷所吸 弓丨。通常可提高缓冲液的离子强度（电导值）与溶质竞争离子交换介质的带电位点，来实 现洗脱。改变pH从而改变溶质带电荷量是实现溶质洗脱的另一种方法。导电率或pH的改 变可以是逐渐的（梯度洗脱）或分步的（分步洗脱）。在过去，这些改变是渐进的，pH或导 电率单向增大或减小。
[0003]目前已经有许多有关利用阳离子层析纯化蛋白的方法，例如中国专利 200410068790. 3公开了使用阳离子交换层析去除酸性污染物，使用提相对高电导值来去除 酸性污染物，然后降低电导平衡，接着再提高电导来洗脱。pH在使用过程中不变。纯化结果 为酸性突变体下降了 50%左右，碱性突变体没有提及。中国专利200880119331. X公开了使 用阳离子交换层析提高pH来洗涤、然后降低pH提高电导来去除抗体中的CHOP (中国仓鼠 卵巢蛋白质)、脱落的蛋白A、DNA、聚体等，并没有针对抗体中的酸性、碱性相关蛋白。
[0004] 上述方法虽然部分达到了纯化蛋白的目的，但存在着酸性和碱性相关蛋白去除率 不高，目标蛋白损失率大的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明利用改变缓冲液的pH和盐的浓度来分离酸性、碱性相关蛋白和目的蛋白， 在酸性低pH和相对高盐浓度的溶液条件下上样，在碱性高pH和相对低盐的溶液的条件下 洗涤、洗脱。最终酸性相关蛋白的去除率大于85%，甚至高达93%，碱性相关蛋白的去除率大 于59%，目标蛋白损失率小于26%。
[0006] 更具体地，本发明公开了一种从包含重组蛋白和其相关蛋白的混合物中纯化该重 组蛋白的方法，该方法包括依次进行的下列步骤：
[0007]A、用第一种平衡缓冲液使重组蛋白结合到离子交换介质上，其中第一种平衡液处 于第一电导率和pH ;
[0008] B、用第二种平衡缓冲液继续平衡已结合蛋白的离子交换介质，其中第二种平衡液 处于第二电导率和pH ;
[0009] C、用不同pH的洗涤液洗涤离子交换介质，从而从离子交换介质上洗脱下第一类 相关蛋白，其中洗涤液处于第三电导率和pH是逐步增加的；
[0010] D、用第一种洗脱液洗脱离子交换介质，从而从离子交换介质上洗脱下目的重组蛋 白，其中第一种洗脱液处于第四电导率和pH ;
[0011] E、用第二种洗脱液继续洗脱离子交换介质，从而从离子交换介质上洗脱下第二类 相关蛋白，其中第二种洗脱液处于第五电导率和pH。
[0012] 其中，上述离子交换介质是阳离子交换介质，指结合在不同基质上的功能基团 为S03_的填料，可为但不限于羧基-甲基-纤维素、BAKERBOND ABX?、固定在琼脂糖上的 磺酸丙基（sulphopropyl) (SP)(如 GE 的 SP-SEPHAROSE FAST FLOW? 或 SP-SEPHAR0SE HIGH PERFORMANCE?)、固定在聚苯乙烯二乙烯苯基 Polystyrene/divinyl benzene 上的 S0URCE-30S、S0URCE-15S，AB公司的Poros HS Poros XS和固定在琼脂糖上的磺酰基（如 Pharmacia的S-SEPHAROSE FAST FLOW?)和Bio-rad公司的固定在亲水性聚丙烯酰胺类上 的 NUVIA-S、UNOsphere-S 等。
[0013] 第一类相关蛋白PI (isoelectric point,等电点）低于重组蛋白PI，重组蛋白 PI低于第二类相关蛋白，更具体地，第一类相关蛋白是重组蛋白的酸性突变体，定义为在 CEX-HPLC上保留时间小于目标蛋白的那一类物质。第二类相关蛋白是重组蛋白的碱性突变 体，定义为在CEX-HPLC上保留时间大于目标蛋白的那一类物质。
[0014] 上述的第二种平衡缓冲液的电导率比第一种平衡缓冲液低，但pH两者相同，具体 地，第一种平衡液为含盐的缓冲液，一般使用的缓冲液有PB、MES、醋酸，最好选择醋酸缓冲 液，缓冲液浓度控制范围在10-50mmol/L，最好在20mmol/L。pH控制在pH4. 0-6. 0,比较好 的控制范围在pH4. 9-5. 1，最好在pH5. 0。盐的种类有氯化钠、硫酸铵、氯化钾、氯化铵、硫酸 钾等盐，最好选择硫酸铵。盐浓度控制范围在10_70mm〇l/L，最好在40_60mmol/L，电导控制 范围在8-13ms/cm。使用60mmol/L的硫酸铵更有利于酸性相关蛋白的流出；第二种平衡液 为不含盐的缓冲液，一般使用的缓冲液有PB、MES、醋酸，最好选择醋酸缓冲液，缓冲液浓度 控制范围在10-50mmol/L，最好在20mmol/L。pH控制在pH4. 0-6. 0,比较好的控制范围在 pH4. 9-5. 1，最好在 pH5. 0。电导一般在 l_2ms/cm，最好在 1. lms/cm。
[0015] 洗涤液的电导率比第一种平衡缓冲液低，但pH高于第一和/或第二种平衡缓冲 液。
[0016] 第一种洗脱液的pH比洗涤液高，但电导率基本相同。第二种洗脱液的pH和/或 电导率比第一种洗脱液高。
[0017] 洗涤液和第一种洗脱液是通过调整两种不同pH的含盐的缓冲液的混合比例来实 现的。缓冲液可以选择磷酸盐、ffiPES、BICINE等，最好选择磷酸盐。缓冲液浓度控制范围 在10_50mmol/L，最好在10mmol/L，电导范围一般在l_2ms/cm，一般不控制。一种缓冲液A 的pH可以在7. 0-7. 8,最好在7. 5, 一种缓冲液B的pH在9. 3-9. 4。盐的种类有氯化钠、 硫酸铵、氯化钾、氯化铵、硫酸钾等盐；更具体地，洗涤液和第一种洗脱液的pH改变是通过 25%Na 2HP04pH7. 5+75%Na2HP04 pH9. 3-9. 4 改变到 15%Na2HP04 pH7. 5+85%Na2HP04 pH9. 3-9. 4 来实现的。
[0018] 第二种洗脱液是高盐的水溶液，盐的种类有氯化钠、硫酸铵、氯化钾、氯化铵、硫酸 钾等盐，优选氯化钠。
[0019] 各种缓冲液存放一般在4-30摄氏度，最好在4-8摄氏度。
[0020] 重组蛋白，优选重组抗体(例如重组抗HER2抗体）经过CH0细胞表达后，使用碟式 离心技术和深层过滤收集上清液。然后通过protein-A亲和层析，使用pH酸性的柠檬酸来 洗脱，获得含目标蛋白、酸性、碱性相关蛋白的均一混合液。此混合液即是阳离子层析(例如 Nuvia-S)的上样液。
[0021] 将上样液通过TRIS-base/氢氧化钠等碱性物质调节至pH4. 0-6. 0,比较好的控制 范围在pH4. 9-5. 1，最好在pH5.0, pH调节完成后，加入氯化钠/硫酸铵等盐析盐来调节电 导，使用带温度补偿的电导率仪，例如梅特勒公司的seven-easy电导率仪，使用20摄氏度 为参比温度，调节电导控制范围在6. 0-18. Oms/cm，最好控制在8. 0-12. 5ms/cm。
[0022] 本发明使用两种不同的上样电导，一种为8.4ms/cm，另一种为12. Oms/cm，在相同 pH下采用高电导上样有利于酸性相关蛋白的流出，一般可以有10-20%比例的酸性峰流出 而目的蛋白流失率可以忽略不计。样品pH和电导调节完毕后放于4摄氏度，这样可以减缓 目的蛋白的进一步水解。
[0023] 层析柱经装填后需要达到使用要求，一般控制柱效在2000每米塔板数以上。层析 过程流速一般控制在5cm/min。层析柱载量控制在10-20mg/ml，最好控制在15mg/ml。蛋 白定量使用280nm紫外分光光度计，重组抗体，比如抗HER2人源化单克隆抗体消光系数为 1. 50。
[0024] 层析控制上先使用第一种平衡液平衡层析柱，一般3CV可以平衡完毕即可上样。 上样后继续使用第一种平衡液平衡至少1CV，再用第二种平衡液平衡至少1CV，此步的目的 在于去除平衡液中的盐以防止影响洗涤步骤。接着使用100%A的洗涤液洗涤2CV以提高 pH。使用60%B-75%B的洗涤液来洗涤层析柱，用以去除酸性相关蛋白。洗涤步骤可以单步洗 涤也可以多步洗涤，一般情况至少使用75%B单步洗涤，多步洗涤