红毛五加多糖、提取及提纯方法、组成分析方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种天然植物活性成分、提取及提纯方法、组成分析方法和用途，更特 别地涉及一种红毛五加多糖、提取及提纯方法、组成分析方法及其用途，属于植物活性成分 及其提取、分析和应用领域。
【背景技术】
[0002] 中药红毛五加皮是五加科五加属红毛五加（Acanthopanax giraldii Hams)的莖 皮，是我国传统的著名药材，在中药领域有着广泛的应用。
[0003] 红毛五加皮性温、味辛，入肝、肾经，具有多种药用功能，如祛风湿、通关节、强筋骨 等功效，在临床上主治瘘痹、拘挛疼痛、风寒湿痹、足膝无力、皮肤风湿及阴瘘囊湿等多种疾 病。
[0004] 虽然对红毛五加的研宄的日益深入，人们已经从红毛五加中分离的了多种多糖成 分，该成分具有显著的药物活性。大量实验研宄发现，红毛五加中多糖成分具有显著的抗病 毒、抗肿瘤、抗炎、保肝等作用。
[0005] 也正是由于红毛五加多糖的如此显著作用，人们对其提取和纯化方法等进行了大 量的深入研宄，取得了一定的成果，例如：
[0006] 施亚琴等人（"红毛五加多糖的提取及含量测定"，《华西药学杂志》，1994年，第9 卷第2期，73-74页）公开了一种红毛五加多糖的提取方法，是将红毛五加皮粉碎，置于索氏 抽提器中，依次用石油醚、乙醚、乙醇进行回流；残渣用水回流提取，合并提取液，滴加NaOH 溶液，减压浓缩，再加入乙醇，静置、过滤，沉淀用乙醇、丙酮反复洗涤，得到疏松的红毛五加 多糖纯品。
[0007] 郭辉等人（"红毛五加粗多糖脱蛋白工艺比较"，《现代中药研宄与实践》，2004年， 第18卷第6期，53-55页）公开了一种红毛五加粗多糖的脱蛋白研宄，首先将红毛五加茎皮 经水提醇沉法得到红毛五加粗多糖，然后分别考察了 Sevag法脱蛋白和三氯乙酸脱蛋白， 结果发现前者效果要优于后者。
[0008] 郭辉等人（"用高效凝胶色谱法测定红毛五加多糖组分的分子量"，《中国药师》， 2005年，第8卷第7期，551-552页）公开了将红毛五加茎皮水提、醇沉、Sevag脱蛋白，透 析除去小分子物质，然后上DEAE-纤维素DE 23阴离子交换层析柱纯化，得到红毛五加精制 多糖，再上Sephadex G-100层析柱分离，氯化钠洗脱，得到多个均一组分。
[0009] CN1073599A公开了一种红毛五加多糖及其制剂的制备方法，所述方法为：将红毛 五加茎皮经分选除杂，用粗粉碎机轧碎，在煮提锅中煎煮三次，将三次煮提滤液混合、过滤， 其滤液减压浓缩至呈现稀流浸膏状，放凉，置于离心机中离心分离，取出上清液，弃去沉淀 物。将上清液加入85%以上的乙醇充分搅动，静置，上清液去回收乙醇，粗多糖沉淀物离心 甩干，用乙醇洗涤，然后冷冻干燥，粉碎，包装。该方法得到的红毛五加多糖收率高，步骤简 便，成本低廉，制备的多种剂型，通过药效学实验证明具有调节人体免疫功能，防治艾滋病， 抗肿瘤的作用。
[0010] CN1834108A公开了一种从红毛五加茎皮中提取、分离、纯化得到的红毛五加多糖， 所述多糖的重均分子量在20000-40000道尔顿之间，主要由阿拉伯半乳聚糖蛋白、鼠李糖 半乳糖醛酸聚糖、半乳糖醛酸聚糖和阿拉伯半乳聚糖组成。使用适量的该红毛五加复合多 糖，加入一种或多种药学上可以接受的辅剂，可制成注射剂，该注射剂可用于治疗中性粒细 胞减少症、贫血、血小板减少症，病毒感染性疾病和作为抗癌的辅助剂，可单独用药，也可与 其它多糖或G-CSF等联合用药。
[0011] CN103724444A公开了一种红毛五加多糖的超声波提取方法，所述方法包括：将红 毛五加于70-80°C烘干，粉碎机粉碎；按照红毛五加与水重量比为1:20-22加水浸泡，并以 超声波辅助提取红毛五加多糖，过滤后得提取液；将提取液减压浓缩至原体积1/10-1/12， 加入三氯醋酸充分溶解后静置10-12小时，过滤收集滤液；滤液中加入乙醇充分搅拌、静 置，收集沉淀；用水复溶后冷冻干燥，既得红毛五加多糖。所述方法可显著提高多糖提取率， 缩短提取时间、能耗低，所得红毛五加多糖对化疗药物导致的免疫力低下，有明显的改善作 用。
[0012] 如上所述，现有技术中已经公开了多种红毛五加多糖的提取方法、组成分析以及 用途研宄等，但这些方法均存在一定的缺陷，例如提取得率低、提取方法单一等，且得到的 红毛五加多糖分子量在某个范围内，无法得到其它分子量范围内的红毛五加多糖，以及组 成分析方法仍有待扩展和改善等等。因此，如何以更高的得率得到红毛五加多糖，并对其进 行特定的组成分析方法等，这些仍然是广大科研工作者的目标，这也正是本发明得以完成 的动力所在和基础所倚。
【发明内容】
[0013] 为了研宄红毛五加多糖的新颖提取方法、组成分析方法及开发新的用途，本发明 人对此进行了大量深入的研宄，在付出了充分的创造性劳动和经过深入的科学探宄后，从 而完成了本发明。
[0014] 具体而言，本发明主要涉及一种红毛五加多糖、提取方法、组成分析方法及其用 途。
[0015] 第一个方面，本发明涉及一种红毛五加粗多糖的提取方法，所述方法包括如下步 骤：
[0016] A、原料预处理；
[0017] B、分步酶解；
[0018] C、液液萃取；
[0019] D、醇沉，得红毛五加粗多糖。
[0020] 在本发明的红毛五加粗多糖的提取方法中，所述步骤A具体如下：
[0021] 将干燥的红毛五加茎皮粉碎，过100目筛，得到红毛五加粉末；将该粉末用丙酮浸 泡，使其充分膨胀，然后过滤，得到膨胀后粉末；将该膨胀后粉末加入到索氏抽提器中，用乙 酸乙酯与氯仿的混合溶剂回流提取1-2小时，趁热过滤，得到料渣；将料渣充分干燥完全， 得到干燥残渣。
[0022] 其中，在步骤A中，所述红毛五加粉末与丙酮的质量体积比为l:4_8g/ml，即每lg 红毛五加粉末用4-8ml丙酮浸泡，例如可为l:4g/ml、l:6g/ml或l:8g/ml。
[0023] 其中，在步骤A中，进行索氏抽提时，乙酸乙酯与氯仿的体积比为1:2-3,例如可为 1:2、1:2. 5 或 1:3〇
[0024] 其中，在步骤A中，所述膨胀后粉末与混合溶剂（即乙酸乙酯与氯仿的混合溶剂） 的质量体积比为l:5-8g/ml，即每lg膨胀后粉末使用5-8ml混合溶剂，例如可为l:5g/ml、 1:6g/ml、1:7g/ml 或 1:8g/ml〇
[0025] 在本发明的红毛五加粗多糖的提取方法中，所述步骤B具体如下（也即步骤B包 括如下步骤）：
[0026] B1 :室温下，将步骤A的干燥残渣加入去离子水中，再加入混合酶，搅拌完全，得到 残渣酶溶液；调节该溶液的pH为6. 5-7. 5,在温度T1下保温酶解50-120分钟，得到初次酶 解液；
[0027] B2 :将初次酶解液进行梯度升温，当温度达到T2时，加入木瓜蛋白酶，并在该温度 下保温酶解40-70分钟，然后以10-15°C /分钟的升温速率将温度升高至沸腾，保持10-15 分钟，使酶灭活，得到二次酶解液。
[0028] 其中，在步骤B1中，干燥残渣与去离子水的质量比为1:5-8,例如可为1:5、1:6、 1:7 或 1:8。
[0029] 其中，在步骤B1中，所述干燥残渣与混合酶的质量比为1:0. 004-0. 01，例如可为 1:0.004、1:0. 006、1:0. 008 或 1:0. 01〇
[0030] 其中，在步骤B1中，所述混合酶为纤维素酶与木聚糖酶的混合物，两者的质量比 为