一种异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被孢霉菌株及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种在高山被抱霉中异源表达亚油酸异构酶基因的工程菌株，特别是 异源表达瘦疮丙酸杆菌来源的亚油酸异构酶基因的重组高山被抱霉菌株及其构建方法，属 于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 共辆亚油酸（Con化gated linoleic acid, CLA)是一类含有共辆双键的十八碳二 締酸，其中两种最重要的活性单体分别是cis-9, trans-11 CLA和trans-10, cis-12 CLA， 均具有抗癌、抗动脉粥样硬化、增强机体免疫力等生理功能。其中trans-10, cis-12CLA还 可W减少体内脂肪积累，从而达到减肥的功效。该两种共辆亚油酸都已经通过了美国FAD 的GRAS认证，可作为安全的食品添加剂使用。但是传统的化学合成方法存在着耗能大、畐U 产物多等诸多问题，从而使得生产条件温和、产物专一的生物法合成共辆亚油酸的开发受 到了越来越广泛关注。
[0003] 自然界中的共辆亚油酸主要来源于反当动物的奶制品或者肉制品中，而某些微生 物如；瘤胃菌、乳酸菌和丙酸菌，也拥有较强的合成共辆亚油酸的能力。微生物合成共辆 亚油酸主要是通过亚油酸异构酶的催化来完成的，按照催化方式的不同，可W分为多酶催 化和单酶催化两类；而单酶催化由于具有便于进行基因工程操作的优势，正在成为生物法 生产共辆亚油酸的研究焦点。到目前为止，已知氨基酸序列并已经分离纯化的单酶催化亚 油酸异构酶分别来源于溶纤维了酸弧菌炬Utyrivibrio fibrisolvens)、罗伊氏乳酸杆菌 (Lactobacillus reuteri)和瘦疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes)。而前两种亚油 酸异构酶均为膜酶，催化生成的CLA产物是cis-9，trans-ll CLA。该两种膜酶在纯化过程 中容易易失活，且具有有较强的底物抑制性，所W相对较难应用于生物转化法生产CLA。因 此，瘦疮丙酸杆菌来源的细胞溶质亚油酸异构酶PAI，成为了较理想的研究对象。PAI可W 作用于游离亚油酸分子的C9双键，催化形成生理功能较强的trans-10, cis-12 CLA，分子 量为48kDa，是目前唯一已知晶体结构的亚油酸异构酶，也是唯一被成功异源表达的亚油酸 异构酶。PAI已经被先后在大肠杆菌、酿酒酵母、烟草种子、大米、乳酸菌W及耶氏解脂酵母 中成功的进行了重组表达。
[0004] 高山被抱霉（Mcxrtierella alpina)是一种产油丝状真菌，脂肪酸可W积累达到 细胞干重的50%，具有较高的多不饱和脂肪酸（PUFAs)含量且种类丰富、分配合理。作为 食品级的工业产油微生物，它已经通过美国农业部（抑A)的安全性评估，是迄今为止生产 PUFAs微生物中唯一具有正式安全性评估（GRA巧的菌种。同时也是脂质生物化学基础研 究的重要模式菌。其生产的花生四締酸（ARA)产品已经成为婴幼儿奶粉的重要添加成分。 亚油酸是高山被抱霉脂质合成过程中的重要中间产物，含量为总脂肪酸的10%左右，可W 作为亚油酸异构酶的潜在底物来源。但目前对高山被抱霉的研究主要集中在菌种选育和 发酵条件优化等方面。而基于基因工程手段来改造高山被抱霉脂肪酸代谢途径的研究鲜 有报道，且多局限于对高山被抱霉自身的同源基因进行的脂质合成基础理论研究。例如： 本研究团队黄小云等人通过克隆高山被抱霉Modierella alpina ATCC 32222菌株中的 ?3脱饱和酶基因（《3 Des)，进一步在M. alpina尿喀晚营养缺陷型菌株MAUUCCFM501， CGMCC No. 8414)中实现过量表达，得到了 EPA产量提高了 6倍的基因工程菌株，其内容已 经在申请号为201410087487. 1的专利申请中公开。Shimizu等人也将克隆自高山被抱霉 1S-4菌株中的《 3脱饱和酶基因在化学诱变的营养缺陷型高山被抱霉中进行了重组表达， 提高了 EPA产量。但到目前为止，尚未有通过引入外源基因来改变高山被抱霉脂质代谢 途径，从而使高山被抱霉具有生产外源功能性脂肪酸种类的报道。所W，我们W申请号为 201310347934. 8专利申请中公开的高山被抱霉尿喀晚营养缺陷型菌株MAU1为宿主菌株， W申请号为201310524221. 4的专利申请中公开的高山被抱霉（Ealpina)重组基因表达系 统为基础，通过根癌上壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens，又名根癌农杆菌）介导的方 法异源表达来源于瘦疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶（PAI)，使得重组菌株具有生物合成共辆 亚油酸的能力，对于产油真菌高山被抱霉的基础理论研究及产品开发具均有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种异源表达瘦疮丙酸杆菌来源的亚油酸异构酶基因的 重组高山被抱霉菌株。本发明的目的还在于提供一种构建异源表达瘦疮丙酸杆菌来源的亚 油酸异构酶基因的重组高山被抱霉菌株的方法。本发明的另一个目的是将所述重组高山被 抱霉菌株用于生产脂肪酸，即生物合成共辆亚油酸的用途。本发明的再一个目的是提供一 种含有质粒地IG2-ura5s-〇PAI的根癌农杆菌。
[0006] 一方面，本发明提供了一种异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被抱霉菌株， 该菌株是用含亚油酸异构酶基因的根癌农杆菌转化高山被抱霉尿喀晚营养缺陷型菌株构 建而成的，该营养缺陷型高山被抱霉MAU1 (CCFM501)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中屯、，保藏号为CGMCC No. 8414。
[0007] 所述异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被抱霉菌株是用重组质粒 pBIG2-ura5s-PAI或地IG2-ura5s-〇PAI转化根癌农杆菌后，进一步用经转化的含质粒 pBIG2-ura5s-PAI或地IG2-ura5s-〇PAI的根癌农杆菌转化高山被抱霉尿喀晚营养缺陷型 菌株构建而成的，所述亚油酸异构酶基因来自天然的瘦疮丙酸杆菌基因（PAI) W及由天然 的基因序列根据宿主密码子使用偏好性进行密码优化并经过人工合成的基因（oPAI)，所述 高山被抱霉尿喀晚营养缺陷型菌株是MAUUCCFM501，CGMCC No. 8414)，所得到的重组高山 被抱霉菌株 Modierella alpine oPAI，其保藏编号为 CGMCC No. 10321。
[000引该株重组高山被抱霉也保藏于位于中国江苏省江南大学食品微生物菌种保藏中 屯、（Qilture collection of Food Microbiology,简称 CCFM)，其保藏编号为 CCFM690。
[0009] 另一方面，本发明提供了一种构建异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被抱霉 菌株的方法，包括W下步骤：
[0010] a) W含有天然亚油酸异构酶基因的质粒PMD19T-PAI为模板，利用PCR扩增 获取PAI基因，根据高山被抱霉的密码子使用偏好表，利用Genscript化timumGene? system(金斯瑞，南京，中国）对PAI序列进行密码子优化，并人工合成oPAI基因；
[OCm] b)分别构建重组质粒地IG2-ura5s-PAI 或地IG2-ura5s-〇PAI ;
[001引 c)分别用构建获得的重组质粒地IG2-ura5s-PAI或地IG2-ura5s-0PAI转化根癌 ±壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens，又名根癌农杆菌）；含有质粒地IG2-ura5s-0PAI 的根癌农杆菌巧8C1的保藏号为CGMCC No. 10181。
[0013] d)分别用经过转化的含重组质粒地IG2-ura5s-PAI或地IG2-ura5s-〇PAI的根癌 农杆菌转化高山被抱霉尿喀晚营养缺陷型菌株；
[0014] e)筛选鉴定转化菌株，获得异源表达亚油酸异构酶（PAI)的重组高山被抱霉 Mortierella alpine-PAI 和 Mortierella alpine-oPAI
[0015] 在本发明中，所述构建异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被抱霉菌株的方法 的步骤C)中所使用的根癌农杆菌为；Agrobacterium tumefaciens C58C1。
[0016] 所述亚油酸异构酶基因来自瘦疮丙酸杆菌，所述构建异源表达亚油酸异构酶基因 的重组高山被抱霉菌株的方法的步骤d)中所使用的高山被抱霉尿喀晚营养缺陷型菌株是 高山被抱霉Modierella alpine MAUUCCFM501)，其保藏编号为CGMCC No. 8414,该菌株已 在申请号为201310347934. 8的中国发明专利申请中公开。
[0017] 所述构建异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被抱霉菌株的方法的步骤b) 中构建重组质粒地IG2-ura5s-PAI或地IG2-ura5s-〇PAI时，利用高山被抱霉基因操作通 用载体地IG2-ura5s-Its(例如参考中国专利申请CN 201310524221.4)和亚油酸异构 酶基因PAI或oPAI。高山被抱霉（Ealpina)重组基因表达系统构建方法已在申请号为 201310524221. 4的中国发明专利申请中公开。
[0018] 所述构建异源表达亚油酸异构酶基因的重组高山被抱霉菌株的方法的步骤a)中 扩增亚油酸异构酶基因的引物序列如下：
[0019] P1(sense) ；TACCCAAGCTTCCATCTCGAAGGATTCAC
[0020] P2 (antisense) ；TACCCGAGCTCTTATCACACGAAGAACCGCGTC
[002U 密码子优化后的PAI基因（即oPAI)序列加入化nd m和Sac I酶切位点序列后 人工合成全基因并亚克隆入PUC-simple载体中。
[0022] 所述构建亚油酸异构酶基因的重组高山被抱霉菌株的方法的步骤e)中筛选鉴定 转化菌株的方法包括W下步骤：
[002引 1)用5血生理盐水冲刷GY平皿表面，收集抱子液于一个无菌1. 5血离屯、管中，过 25 y m滤膜；
[0024] 。稀释立个浓度梯度（107L、lOVU 107L)，分别取150化涂布于含有100 y g/mL 壮观霉素，100 y g/mL头抱唾目亏的GY-CS平板上，25°C培养2-3天；
[0025] 3)用无菌綴子挑出生长的真菌菌丝于SC-CS平板上，25°C培养2-3天；
[0026] 4)观察高山被抱霉平板上的生长情况，挑出在SC-CS平板上生长的菌丝接种