一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌。
【背景技术】
[0002]α-淀粉酶全称为α-1，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉时，可从分子内部切开α -1，4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基Cl碳原子为α-构型，故得名为α-淀粉酶。
[0003]耐高温α-淀粉酶广泛存在于动物(唾液、胰脏)、植物(大麦)和微生物中，是一种内切葡萄糖苷酶。它能在较高的温度下迅速水解淀粉分子中的α-1，4葡萄糖苷键，任意切割淀粉成长短不一的短链糊精和少量的低聚糖、葡萄糖和麦芽糖，从而使淀粉糊的粘度迅速下降，是目前最重要的工业酶制剂之一，约占酶制剂市场份额的25%。耐高温α-淀粉酶不同于中温α-淀粉酶和普通高温α-淀粉酶，具有优越的耐热性能、酶活力高和较宽的pH适应范围等特性，广泛应用于造纸、纺织、印染、柠檬酸、乳酸发酵、啤酒、酒精、味精、淀粉糖(葡萄糖、饴糖、糊精、果糖、低聚糖)等工业领域，用量大，市场占有率高，应用前景非常广阔。
[0004]耐高温α -淀粉酶的来源主要为古菌和真细菌，最适作用温度都在60°C以上，古菌一般在各种极端的条件下生存，如高温、高渗、强酸、强碱等，维持它们的生命活动的很多蛋白质也是适应其生存环境的。因此，古菌来源的耐高温α-淀粉酶较真细菌能耐受更高的温度，虽然古菌α -淀粉酶耐热性能较好，但它们最适生长温度较高，多为80°C以上，生长条件较为苛刻，并不适合工业化生产的要求。因此，芽孢杆菌属仍然是研究的重点。从50年代开始，人们就着手从高温土壤中筛选出发菌株来研究耐高温α-淀粉酶。近年来人们对高温土壤中，特别是温泉附近土壤中，筛选到了耐高温α -淀粉酶的凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌，可见高温菌在耐高温α-淀粉酶研究中仍然十分重要。自1973年Madsen等报道了采用常温地衣芽孢杆菌得到了一种新的耐高温α -淀粉酶开始，人们尝试从中温菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中获得耐高温α -淀粉酶，这给耐高温α-淀粉酶的研究开辟了一条新途径。目前工业化应用的耐高温α-淀粉酶多是来自常温牙抱杆囷属。
[0005]枯草芽孢杆菌是当今工业酶制剂生产应用最广泛的菌种之一。由于枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β -葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50%。并且产酶量高、种类多、安全性好和环保，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种。
[0006]中国专利CN102363761A公开了一种产耐高温α -淀粉酶菌种的优化方法，采用地衣芽孢杆菌10181从菌种活化、菌种扩培到发酵提取整个过程进行优化，该菌种所产的耐高温α -淀粉酶其酶活一般在2500u/ml，耐受温度为95°C。中国专利CN101838635A公开了一种耐高温淀粉酶的制备方法，将地衣芽孢杆菌进行菌种复壮培养、种子培养，经液体深层发酵而成的耐高温α-淀粉酶其酶活力高达20000-22000u/ml，耐受温度高达110°C。中国专利CN100415879C公开了耐酸耐高温的α -淀粉酶及其制备方法，用重组DNA技术定点突变前体α -淀粉酶，从微生物特别是地衣芽孢杆菌中分离前体α -淀粉酶基因，对其L134及S320的氨基酸残基进行突变，并在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等细菌中高效表达α -淀粉酶突变体，较适宜在枯草芽孢杆菌中表达，使耐酸ΡΗ4.0-4.5，且高温70-900C的α -淀粉酶得以高效表达.α -淀粉酶突变体具有良好的酸稳定性，更适于工业化应用，为耐酸性、耐高温α-淀粉酶的工业化大生产提供了一条可行途径。
[0007]如上所述，随着生物技术的发展，会有更多的分离菌、诱变菌、基因工程菌及其组合会应用到耐高温α-淀粉酶的生产中来，以满足日益增长的工业化生产需求。
[0008]目前，虽然有很多本领域技术人员对生产耐高温α-淀粉酶进行了不懈研究，但仍然存在以下不足:1.酶活力低，后处理工序复杂、生产成本相对较高；2.耐受的温度很难超过95°C，液化效果不理想；3.最适pH值范围较狭窄，不适合“二酶法”生产工艺；4.发酵及提取过程含有杂质，应用范围受到限制。为了降低生产成本、拓展作用条件及范围，满足市场需求，需要开发或者优化出一株产酶活力高、作用条件宽泛的菌株，直接筛选出具有生产稳定性好、菌种适应强的出发菌株是很多研究的初始步骤。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一株生产耐高温α -淀粉酶的枯草芽孢杆菌。
[0010]本发明提供的产耐高温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) L1-2013-02。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为 CGMCCN0.7926。
[0011]所述菌株特点如下:
[0012]所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。
[0013]所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) L1-2013-02由一株保藏于本实验室的产耐高温α -淀粉酶的枯草芽孢杆菌L1-2010经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下:
[0014](I)菌悬液的制备
[0015]将在平板划线分离后长出的L1-2010单菌落接入种子培养基中，100r/min，40°C培养12h后,取ImL培养液离心后用生理盐水洗漆两次,并重悬与9mL生理盐水中。
[0016](2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变
[0017]将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40°C振荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。
[0018](3)高产菌种的初筛
[0019]将上述涂布均匀的平板，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌L1-2013-A，L1-2013-02，L1-2013-B
[0020](4)摇瓶发酵复筛
[0021]将获得的三株菌L1-2013-A，L1-2013-02, L1-2013-B在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10% (V/V)，40°C、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。
[0022](5)酶活测定
[0023]酶活单位的定义:ImL粗酶液,于105°C、pH4.2条件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即为I个酶活力单位，以U/mL表示。
[0024]经测定，菌株L1-2013-02，为稳定的最高产菌株，且酶活达到31500U/mL。
[0025]所述氯化锂平板:淀粉1%，蛋白胨 1%，(NH)2SO40.4%, K2HPO40.8%, CaCl20.2%，氯化锂0.9%，琼脂2%。
[0026]所述的种子培养基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0027]所述的发酵培养基:玉米粉5%?15%，豆饼粉4%?10%，(NH) 2S040.4 %,K2HPO40.8%, CaCl20.2%?
[0028]所述的摇瓶培养条件:该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10%(V/V)，100r/min、40°C 发酵培养 72h。
[0029]由菌株Kl-1发酵获得了一种耐高温的α-淀粉酶，其酶学性质如下:
[0030](I)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在101-110°C之间，且在110°C以下保存的温度稳定性较好，而110°C以上保存长时间温度稳定性较差。
[0031](2)该酶最适反应pH值为4-5。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。
[0032](3)酶活性:由本发明所提供的突变株L1-2013-02，制备的耐高温α -淀粉酶酶活