低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征JXA1-R株病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医生物学技术领域，具体涉及低血清培养Marc-145细胞生产猪繁 殖与呼吸道综合征JXA1-R株病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 目前我国动物疫苗生产工艺相对落后，生产病毒所用的细胞绝大部分来自转瓶培 养，且主要采用最基础的合成细胞培养基，甚至天然培养基（如水解乳蛋白）加入10%左右 新生牛血清，该些动物来源成分带来的疫苗安全、质量和成本等问题已经凸显。主要表现 在：①牛血清用量大，使细胞的生长状况对血清的依赖性大，但是血清是一种成分不确定的 混合物，批与批之间的组分存在差异，直接影响产品质量的稳定性；②增加生产成本；③血 清来源于动物，有可能携带传染源，对正在生长的细胞或者产品带来危险。在生产过程中控 制和减少动物来源成分已成为一种趋势。美国抑A和美国农业部已经严密控制在细胞培养 中胎牛血清的使用，W降低动物血清可能携带的传染源对细胞和制品带来的风险。降低新 生牛血清的用量甚至不使用新生牛血清已成为目前生物制品发展的方向。
[0003] Marc-145细胞即恒河猴胚肾上皮细胞，广泛用于猪繁殖与呼吸综合征疫苗的生 成，目前，国内各厂家使用的是传统的转瓶培养工艺生成该疫苗。微载体息浮培养技术将逐 步代替传统技术，但是进口微载体的价格较高。不论是传统的转瓶培养技术，还是先进的生 物反应器息浮培养技术，均采用高血清含量细胞培养技术。该传统工艺效率低、生产成本 高；不同血清批次间差异显著；放大重现性较差；对下游纯化工艺要求高；容易出现血清出 复杂成分导致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前全球血清供应趋 紧，该大大影响了疫苗企业的生产效率。因此低血清培养技术的应用势在必行。经检索，未 有关于低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征JXA1-R株病毒的相关文献报 道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供低血清培养Marc-145细胞生产猪 繁殖与呼吸道综合征JXA1-R株病毒的方法，该方法可W显著降低生产成本，同时可W提高 下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
[0005] 本发明的目的通过W下技术方案来实现；低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖 与呼吸道综合征JXA1-R株病毒的方法，它包括W下步骤：
[000引 S1.巧IJ备用细胞的传代与培养：
[0007] 取T75瓶培养铺满单层Marc-145细胞，经邸TA-膜酶细胞分散液消化细胞，用细 胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Marc-145细胞置于温度为37 + 2°C的 二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为 10%血清含量的016]?或肥]\1培养液；
[0008] S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括W下子步骤：
[0009] S21.第一代细胞的驯化：
[0010] 将步骤S1扩大培养的Marc-145细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所 述第一代低血清培养基为含10 %血清的DMEM或MEM培养液和含5 %血清的默克MD低血清 培养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，血清的含量为 8. 3% ；
[0011] S22.第二代细胞的驯化：
[0012] 将驯化的第一代Marc-145细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第 二代低血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培 养液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1: 1，血清的含量为 7. 5% ；
[0013] S23.第H代细胞的驯化：
[0014] 将驯化的第二代Marc-145细胞接种到第H代低血清培养基中进行驯化，所述第 H代低血清培养基为含10 %血清的DMEM或MEM培养液和含5 %血清的默克MD低血清培养 液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2,其中血清的含量为 6. 7% ；
[0015] S24.第四代细胞的驯化：
[0016] 将驯化的第H代Marc-145细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第 四代低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5% ;
[0017] S3.驯化细胞适应低血清培养环境：
[0018] 使用T75细胞瓶，37C静态培养驯化的第四代Marc-145细胞，培养液为默克MD低 血清培养基和血清的混合液，血清的含量为1~5%，即为生产用种子细胞；
[0019] S4.细胞毒种的繁殖：
[0020] 用病毒培养液将猪繁殖与呼吸道综合征JXA1-R株病毒种毒按2% (v/v)的比例接 种到生产用种子细胞单层中进行培养，培养66~8化后收获病毒。
[0021] 进一步地，所述邸TA-膜酶细胞分散液为质量分数为0. 10~0. 25 %的膜酶和 0. 02%的邸TA的Hank' S液的混合液。
[0022] 进一步地，步骤S4中所述的病毒毒种培养液为低血清培养基、血清和抗生素的混 合液，其中，血清的含量为0~1%，抗菌素的含量为100~200IU/mU且混合液的抑值为 7. 2 ~7. 4。
[0023] 上述技术方案中，低血清培养基为默克MD系列干粉低血清培养基，在使用前，需 按照说明书配成溶液，具体方法如下；1)将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用 水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温2(TC~3(TC)到17.5升，轻微 揽拌溶解；2)加入23克碳酸氨轴；3)轻微揽拌溶解，加注射用水至20升；4)如果必要，用 Imol/L氨氧化轴溶液或Imol/L盐酸溶液调抑至7. 2-7. 4 ;5)用0. 2 y m滤膜正压过滤除 菌；6)溶液应在2 °C -8 °C下避光保存。
[0024] 本发明具有W下优点：本发明低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综 合征JXA1-R株病毒生产疫苗中使用低血清培养基可有效降低培养液中的牛血清使用量， 并能提高细胞密度及生物制品的产率；本发明Marc-145细胞在低血清培养基的生长情况 甚至优于加入10%牛血清的传统培养基，且能提高细胞密度、提高病毒滴度，获取同样的细 胞量，用低血清培养基将比用传统培养基缩短近1/3的时间，可提高生产效率。因此，本发 明提供低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征JXA1-R株病毒的方法可W显 著降低生产成本，同时可W提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量 易于实现均衡稳定。
【附图说明】
[002引 图1为实施例3中血清添加比例为1%时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a 的培养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[002引 图2为实施例3中血清添加比例为2%时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a 的培养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[0027] 图3为实施例3中血清添加比例为3%时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a 的培养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[002引 图4为实施例3中血清添加比例为4%时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a 的培养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[002引 图5为实施例3中血清添加比例为5%时Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a 的培养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[0030] 图6为实施例3中对照组Marc-145细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为 2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[0031] 图7为实施例4中低血清培养液驯化的Marc-145细胞接种猪癌病毒后病变情况， 其中，图a的血清添加比例为1 %，图b的血清添加比例为2%，图C的血清添加比例为3%， 图d为对照组，图e的血清添加比例为4%，图f的血清添加比例为5%。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于W下所 述。
[003引实施例1 ;低血清培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征JXA1-R株病毒 的方法，它包括W下步骤：
[0034] S1.巧[J备用细胞的传代与培养：
[00巧]取T75瓶培养铺满单层Marc-145细胞，经邸TA-膜酶细胞分散液消化细胞， 邸TA-膜酶细胞分散液为质量分数为0. 15 %的膜酶和0. 02 %的邸TA的Hank' S液的混 合液；用细胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Marc-145细胞置于温度为 37±2C的二氧化碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞 生长液为10 %血清含量的DMEM培养液；
[0036] S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括W下子步骤：
[00