一种来源于里氏木霉的新(r)-转氨酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物催化领域，主要涉及一种来源于里氏木霉的新（时-转氨酶及其 在生产手性胺和非天然氨基酸方面的应用。
【背景技术】
[0002] 手性胺和非天然氨基酸在医药、食品、化妆品等高附加值领域具有广泛的应用。例 如（时-4-苯下基-2-胺（抗高血压药Dilevalol的前体）、苯基异丝氨酸（目-氨基酸，抗 癌药紫杉醇的侧链部分）和Cispentacin (环状目-氨基酸，抗真菌药物）等皆为药物合成 的关键中间体或者关键手性模块，D-丙氨酸等非天然氨基酸越来越多被用于高级化妆品。 另外，研究表明，含有非天然氨基酸的多肤应对蛋白酶降解的稳定性高于天然多肤，并且仍 然保持其生物活性。该显示在研发高稳定性且不被人体排斥的新药、抗体W及人造蛋白质 方面，非天然氨基酸或将发挥不可替代的作用。然而，与天然氨基酸不同，手性胺和非天然 氨基酸尚不能通过发酵法进行工业化生产，现在主要依靠有机合成法进行生产。有机合成 法的不足是不易得到光学纯的产物，而且通常需要高压高温高能耗，因此亟需实现手性胺 和非天然氨基酸的绿色生产。
[0003] 转氨酶，又叫氨基转移酶，是催化氨基化合物和撰基化合物之间氨基可逆转移 (兵兵机制）的一类酶，根据其底物氨基的位置，可W分成a-转氨酶和转氨酶。a-转 氨酶较为常见，只能催化a-氨基的转移；而转氨酶则较为罕见，除了能催化a-氨基 的转移，也能催化非a位氨基的转移，具有更为宽广的底物谱和严格的立体选择性，能够 在温和条件下拆分胺消旋体（附图la)或者催化前手性底物撰基上的不对称加氨（附图 lb)来生产手性胺及非天然氨基酸。另外，转氨酶W磯酸化唆酵（PL巧为辅基，催化反应 过程中无需添加额外的辅因子循环，该在工业应用中很有优势。总之，用转氨酶来生产 光学纯的手性胺和非天然氨基酸，可W避免传统化学法的高压高温高能耗高污染，是符合 绿色生产理念的先进生物制造，显示出替代有机合成法的巨大潜力。例如，2010年Science 报道了 Codexis公司与Merck公司的研究成果，采用（时选择性的转氨酶成功替代了 基于贵金属错催化的化学法来工业化生产抗糖尿病药物西他列汀（一种手性胺）。
[0004] 严格的立体选择性是酶区别于化学催化剂的关键特性，所W获得特定立体选择 性的酶，是后续研究改造和工业应用的重要基础。根据文献报道，《-转氨酶中（巧选择 性的酶较为常见，而（时选择性的转氨酶（下文称为（时-转氨酶）却较为稀有（[1] Koszelewski D，Tauber K，Faber K，et al. co-Transaminases for the synthesis of non-racemic a -chiral primary amines[J]. Trends in biotechnology，2010,28 (6)： 324-332. [2]Mathew S，Yun 吐 CO-Transaminases for the production of optically pure amines and unnatural amino acids [J]. Acs Catalysis, 2012,2(6) :993-10〇]_)。至今为 止，国内尚未有（R)-转氨酶的报道。因此，发掘具有工业应用潜力的新（R)-转氨酶对手性 胺和非天然氨基酸的绿色生产具有特殊的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为手性胺和非天然氨基酸的绿色生产提供一种具有工业应用潜 力的（时-转氨酶。
[0006] 本发明目的是通过如下技术方案实现的：
[0007] 一种来源于里氏木霉Trichoderma reesei QM6a的新（R)-转氨酶（称为HTR)，其 基因核巧酸序列如SEQ NO. 1所示，其氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
[0008] 本领域研究者对新（时-转氨酶HTR进行蛋白质工程改造（例如氨基酸残基保守 置换、氨基酸序列增长截短、合理设计、定向进化、酶的化学修饰等）所获得的（时-转氨酶， 也属于本发明的范围。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种制备新（时-转氨酶HTR的方法。
[0010] 该制备方法包括W下步骤；（1)通过基因全合成技术获得编码新（时-转氨酶HTR 的基因片段。（2)将基因片段构建到祀T28a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。 (3)将重组质粒转入宿主菌细胞（优选大肠杆菌化21 0E3))，获得相应的工程菌株。（4)将 工程菌株接种至LB培养基中，培养至对数期并用0.1 mM的IPTG于25C诱导表达12小时。 (5)离也收集菌体，破菌留取上清液，采用金属亲和层析法（媒柱）纯化回收目的蛋白，并透 析除去咪哇即得HTR纯酶液。SDS-PAGE电泳图谱显示目的蛋白新（时-转氨酶HTR大部分 可溶表达，纯化所得蛋白条带单一，达到了电泳纯（见附图2)。
[0011] 本发明的再一目的是提供新（时-转氨酶HTR的酶学性质、底物谱及应用。
[0012] 本发明的新（时-转氨酶HTR在弱碱性条件下活力较高，其最适反应抑值为8. 0。 新佩-转氨酶HTR的最适反应温度为42。其在5(TC的磯酸盐缓冲液（100mM，pH = 7. 4) 中赔育20分钟后，仍保持90% W上的活力，显示出较好的温度稳定性。
[0013] 本发明的新（时-转氨酶HTR具有宽广的氨基供体底物谱，尤其对各种（时构型伯 胺的活力很局，例如（时-1-苯己胺、（时-1-氨基巧满、（时-2-己胺和（R)-2-庚胺，而对（S) 构型伯胺的活力很低，表现出严格的（时立体选择性。该显示新（时-转氨酶HTR可用于伯 胺消旋体的动力学拆分。
[0014] 进一步地，本发明的新（时-转氨酶HTR能够动力学拆分50mM的1-苯己胺、1-苯 丙胺、1-氨基巧满和1-(4-氣苯基）己胺，转化率皆在50%左右，产物的ee值皆> 99%，获 得了光学纯的（S)-1-苯己胺（附图3)、（巧-1-苯丙胺（附图4)、（巧-氨基巧满（附图5) 和（S)-(4-氣苯基）己胺（附图6)。该些结果，充分显示了本发明的新（时-转氨酶HTR在 动力学拆分胺消旋体获得手性胺方面的应用潜力。
[0015] 本发明的新（时-转氨酶HTR具有宽广的氨基受体底物谱，包括丽、羟基丽、a -丽 酸及目-丽酸醋等，并且其对应产物的ee值大都超过99 %。该显示新（时-转氨酶HTR可 应用于手性胺和非天然氨基酸的不对称合成。
[0016] 进一步地，本发明的新（时-转氨酶HTR能够将20mM和50mM丙丽酸不对称加氨合 成D-a-丙氨酸，转化率分别达到99%和94%，ee值皆>99% (附图7);能够将50mM的 2-丽了酸不对称加氨合成D-a-氨基了酸，转化率达到98 %，ee值>99 % (附图8);能够 将lOmM的2-丽戊酸不对称加氨合成D-a -氨基戊酸，转化率最高达到82 %，ee值> 99 % (附图9)。该些结果，充分显示了本发明的新（时-转氨酶HTR在光学纯非天然氨基酸的不 对称合成方面富有应用潜力。
[0017] 本发明的优点在于；(R)-转氨酶是比（S)-转氨酶更稀有的一类转氨酶，在手 性胺和非天然氨基酸的生物制造中具有特殊意义。本发明公布的新（时-转氨酶HTR具有 严格的（时立体选择性，并且具有宽广的底物谱，在手性胺和非天然氨基酸的绿色生产中 显示出工业应用前景。
【附图说明】
[0018] 附图1为W-转氨酶催化反应示意图。
[0019] 附图2为新（时-转氨酶HTR的SDS-PAGE图谱。1 ;蛋白质分子量标记，2 ;媒柱纯 化所得HTR，3 ;诱导表达后破菌上清液，4 ;诱导表达后破菌沉淀。
[0020] 附图3为HTR动力学拆分1-苯己胺的产物光学纯度检测图谱。
[0021] 附图4为HTR动力学拆分1-苯丙胺的产物光学纯度检测图谱。
[0022] 附图5为HTR动力学拆分1-氨基巧满的产物光学纯度检测图谱。
[0023] 附图6为HTR动力学拆分1-(4-氣苯基）己胺的产物光学纯度检测图谱。
[0024] 附图7为HTR催化丙丽酸不对称加氨的产物光学纯度检测图谱。
[00巧]附图8为HTR催化2-下丽酸不对称加氨的产物光学纯度检测图谱。
[0026] 附图9为HTR催化2-戊丽酸不对称加氨的产物光学纯度检测图谱。
【具体实施方式】
[0027] 下面的实施例进一步说明本发明的部分内容，W便于本领域的技术人员进一步理 解本发明，但不应理解为对本发