海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学、生物化学、酶工程、发酵工程等领域，具体涉及一种低温葡甘聚糖酶海洋微生物发酵生产的方法。
【背景技术】
[0002]葡甘聚糖酶(Glucomannanase)是一种能将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖的可诱导细胞外泌酶(董桂清，广西轻工业，2007)。葡甘低聚糖属于功能性低聚糖，具有极其显著的降脂作用，可以作为高血脂、糖尿病辅助治疗产品(Hsiao-Ling Chen, Journal oftheAmerican College ofNutrit1n, 2003);因其能够减少肠内氨的生成和吸收，可以减轻肝脏对血氨的解毒负担(陈黎，中国生化药物杂志，2003);同时葡甘低聚糖能够提高体内超氧化物歧化酶活性，增强机体抗氧化能力(杨艳燕，中草药，2001)。但是目前有关葡甘低聚糖产品，只有少量出现在国外市场，国内基本无此类产品(周海燕，中国生物工程杂志，2005)。
[0003]国内对于葡甘聚糖酶的研宄尚处于起步阶段，主要包括菌种选育、产酶条件优化、酶分离纯化、酶学性质、基因克隆等(周海燕，湖北农业科学，2005;董桂清，广西轻工业，2007 ;许剑，基因组学与应用生物学，2012 ;)。海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的产业化、规模化生产及应用还未见报道。海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶与中、高温葡甘聚糖酶相比具有很大的应用优势:低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短处理时间并省却昂贵的加热或冷却费用；在节能方面也有相当大的优势；经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质(陈秀兰等，中国农业科技导报，2007)。这些特性将有助于海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的推广和使用。低温葡甘聚糖酶的应用将对传统的食品、医药等领域产生深远的影响。因此，海洋微生物发酵葡甘聚糖酶工业化生产可创造良好的经济效益和社会效益(周海燕，中国生物工程杂志，2005) ο
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法，该方法主要是海洋微生物经过低温驯化后，在24?30°C液体培养基中发酵生产低温葡甘聚糖酶，这种生产方法获得的低温葡甘聚糖酶粗酶液活性可以达到3587U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。
[0005]本发明所述的海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法具体包括以下步骤:
[0006](I)将能产生葡甘聚糖酶的菌种活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30°C — 28°C — 26°C — 24°C，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，NaNO30.2 ?0.7 %，MgSO4.7H20 0.3 ?0.5 %，KCl 0.3 ?0.5 %，K2HPO40.1 ?0.3 %，FeSO4.7H20 0.001 ?0.004%，琼脂 1.8 ?2.0%，自来水 lOOmL，pH 值为 6.0 ?6.5，于0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0007]所述的能产生葡甘聚糖酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号:1.2244或1.504或1.775或5.809 ；
[0008](2)按常规方法将步骤⑴中低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在液体种子培养基上于24?30°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述的液体种子培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，酵母膏0.4?0.9%，蛋白胨0.3?1.0%，NaNO30.2 ?0.7 %，MgSO4.7H20 0.3 ?0.5 %，KCl 0.3 ?0.5 %，K2HPO40.1 ?0.3 %，FeSO4.7H20 0.001 ?0.004%,自来水 10mL, pH 值为 6.0 ?6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0009](3)将液体二级种子按发酵液体积的3?9%接种量接入液体发酵培养基中，在24?30°C培养72?144h时，即海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶结束；所述的液体发酵培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?4.0%，NaNO30.2?0.7%，MgSO4.7H20
0.3 ?0.5%，KCl 0.3 ?0.5%，K2HPO40.1 ?0.3%，FeSO4.7H20 0.001 ?0.004%,自来水 10OmT,, pH 值为 6.0 ?6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0010](4)将步骤(3)的发酵液在4，000?8，OOOrpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液；
[0011](5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
[0012]进一步的，步骤(I)产生葡甘聚糖酶菌种的活化培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，酵母膏0.4?0.9%，蛋白胨0.3?1.0%，NaCl 0.3?0.7%，琼脂
1.8 ?2.0%，自来水 10OmT,,于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min。
[0013]本发明使用的菌种初期活化和生长条件按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供的说明进行。菌株先活化、逐级低温驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温葡甘聚糖酶，低温驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用25?504%甘油制成的菌悬液在_80°C条件下可以长期保藏。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0015](I)本发明利用海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶，经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质，特别是在低温下具有高酶活力及高催化效率，改善并提高产品质量；
[0016](2)本发明简化了生产工艺，缩短加工时间，在节能方面有很大优势；
[0017](3)本发明方法制得的生产的低温葡甘聚糖酶在应用上操作简单、方便、快捷，可以将葡甘聚糖降解为不同聚合度的功能性葡甘低聚糖，该低聚糖具有降血糖、降血脂、抗氧化等生理功能，在食品、医药等方面具有较大应用价值，低温葡甘聚糖酶还可以提高原料利用率及生产效率，降低成本，其应用前景广阔。
【具体实施方式】
[0018]下面通过【具体实施方式】对本发明做进一步说明，但并不限制本发明。如无特殊说明，本发明所用原料均市售可得，优选的，魔芋精粉购自武汉市清江魔芋制品有限公司。
[0019]实施例1
[0020]I)培养基制备
[0021]①菌种活化培养基(wt %):魔芋精粉0.4%，酵母膏0.4%，蛋白胨0.3%，NaCl0.5%，琼脂 1.8%, pH 自然，自来水 100mL，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0022]②菌种低温驯化培养基(wt% ):魔芋精粉0.4%,NaNO30.2%,MgSO4.7Η20 0.3%,KCl 0.3 %, K2HPO40.1%, FeSO4.7Η20 0.001 %，琼脂 1.8 %，自来水 10mL, pH 6.5，于0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0023]③液体种子培养基(wt % ):魔芋精粉0.4%，酵母膏0.4%，蛋白胨0.3%，NaNO30.2 %，MgSO4.7H20 0.3 %，KCl 0.3%, K2HPO40.1 %，FeSO4.7H20 0.001%, g 来水10OmT,, pH 6.5，于 0.1MPa、115°C蒸汽灭菌 15min ；
[0024]④液体发酵培养基(wt%):魔芋精粉 0.4%,NaNO30.2%,MgSO4.7Η20 0.3%, KCl0.3%, K2HPO40.1 %, FeSO4.7Η20 0.001%,自来水 lOOmL，ρΗ6.5，于 0.1MPa、115°C 蒸汽灭菌15min ；
[0025]2)将产生葡甘聚糖酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行初始活化；
[0026]3)活化好的菌种于低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，30°C — 28°C — 26°C — 24°C，驯化8天左右，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温环境中稳定生长即驯化结束；
[0027]4)按常规方法将低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在液体种子培养基中于24?26°C培养48?72h后，按5vt%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子;
[0028]5)将4)制备的二级种子按发酵液体积3?5%的接种量接入5L的液体发酵培养基中，在24?26°C培养120?144h时，即海洋微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶结束；
[0029]6)将5)的发酵液在4，000?8，OOOrpm离心收集上清液，收集到的液体即为粗酶液；粗酶液活性可以达到3500U/mL ；
[0030]7)根据不同需要和使用对象不同，将6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的低温葡甘聚糖酶制剂