OsChls2基因在调控水稻叶绿素含量中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及到一个位于水稻第2染色体上控制 叶绿素含量的基因化化ls2的克隆与应用。
【背景技术】
[0002] 绿色组织是植物进行光合作用的主要场所，其光合效率的提高对作物产量意义重 大。理论上作物产量潜力可根据公式Y=0. 487*St* e i* e C* e P计算（Monteith, 1977)。 研究发现，现代水稻品种合理密植后对光合有效福射的拦截效率e i高达80-90%，收获 指数ep也已达到50-60%，两者进一步提升的空间均十分有限。因总太阳福射能St在 一定地理位置和生长季节是固定的，上式中唯一可用来大幅提高产量的是光能利用效率 e c〇lOTton，2000;化U et al2008;2010)nC3植物最大光能利用效率理论上可达4. 6%，但田 间观测的水稻等作物最大光能利用率往往仅为理论值的1/3,平均光能利用率仅为0. 5%。 叶绿素具有收集和传递光能的作用，反应中也的特殊叶绿素a分子还可W将光能转化为化 学能。研究表明，在作物育种实践中可通过天线叶绿素含量的优化来提高光合效率。
[0003] 叶绿素含量的遗传基础比较复杂，受多个基因调控，是典型的数量性状。利用分 子标记遗传连锁图谱及分离群体可W定位到控制该性状的QTLs，与此同时，还可通过关联 分析对控制该性状的基因进行定位。关联分析是一种W连锁不平衡为基础和前提，通过鉴 定自然群体内各性状与分子标记或候选基因相关性的分析方法，可鉴定控制生物特定性状 的基因区段（Q化）（Gupta et al2005;Ra化lski2010)。与传统giL定位方法相比，关联 分析的优点主要体现在：（0关联分析在精细定位方面更加直接和方便，其作图精度更高 (Buckler et al 2002); (2)关联分析能同时检测到多个等位基因，并有可能鉴定出最优 等位基因；（3)由于关联分析使用的是自然存在的种质资源群体，因此不需要利用多年时 间来构建作图群体（Meuwissen et al2000;Flint-Garcia et al2003;Whitt et al2003; Flint-Garcia et al2005)。
[0004] 通常关联分析有两种策略，包括全基因组关联分析（Genome-Wide Association Study, GWAS)和候选基因关联分析（Candidate Gene Association Sl:udy) (Aranzana et al2005 ;Cockram et al2010 ;Huang et al2010)。但是无论是何种策略，基本包括W 下4个步骤；（1)选择具有高度遗传多样性的种质材料；（2)群体结构分析来避免假阳性 关联；（3)对无数特定的目标性状进行多点、多年、多重复的准确考察（Flint-Garcia et al2003 ;Wilson et al2004) ;(4)在分析了种质材料的群体结构、标记间LD水平和目标 性状的表型数据后，即可运用关联分析软件(如TASS化或AN0VA)进行关联分析（Wu et al2001)。
[0005] 本发明采用新一代测序技术对533份水稻核也种质完成了重测序，建立了全基 因组关联分析平台，并对种质叶绿素含量进行了系统考察，进一步通过全基因组关联分析 (GWA巧检测到具极显著效应的位点。本发明采用关联分析的策略发掘控制叶绿素含量自然 变异主效基因化化ls2,然后在自然群体中挑选部分材料进行了重测序验证，发现在自然群 体中存在5种单倍型，选择其中一个单倍型的等位基因作为转化片段，对其进行超量表达， 发现该等位基因能显著降低水稻叶绿素含量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从水稻中分离克隆一个控制叶绿素含量 基因的完整编码区段DNA片段，并对该基因进行了超量表达研究，发现该基因能极显著降 低水稻叶绿素含量，显然该基因在调控水稻叶绿素含量中具有重要育种价值。申请人将该 基因命名为化化ls2。
[0007] 本发明的目的还包括化化ls2基因在调控水稻叶绿素含量中的应用。
[0008] 未达到上述目的，在本发明中，申请人通过高通量测序技术对533份核也种质进 行了测序，根据测序结果将材料分为不同的亚群。然后通过对ind及aus亚群进行化化ls2 全基因组的深度测序，并对叶绿素含量性状进行了分析，转化试验表明超量表达的家系叶 绿素含量出现了下降。
[0009] 本发明分离克隆的化化ls2 (在本说明书中有时候表述为hap2)主效基因的核巧 酸序列如序列表SEQ ID N0;2所示，其等位基因hapl的核巧酸序列如SEQ ID N0;1所示。
[0010] 根据测序结果将该基因分为5个单倍型，hapl的翻译蛋白与"日本晴"的蛋白序列 一致，而其中hap2在编码区存在3个氨基酸的非同义突变，且有26个碱基的缺失，hap3存 在由移码突变导致一个氨基酸的缺失，导致其翻译蛋白出现了一个氨基酸的缺失，其中编 号为hapl和hap2单倍型的的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO ;4和SEQ ID NO ;6所示。
[0011] 对该基因不同单倍型在部分种质中做了表达量分析，发现hap2和hapl在表达量 上存在极显著差异(见图3)。
[0012] 对所获基因进行了超量表达，发现hap2基因的片段转入水稻中花11 (hapl)后转 基因阳性株出现叶绿素含量下降(见图7A-图7D)。
[0013] 本发明的优点在于；本发明首次在水稻中应用全基因组关联分析的方法找到了一 个控制叶绿素含量的主效基因及它的等位基因，该些基因在水稻高光效育种中具有重要育 种价值。同时本发明也为其它作物中克隆相关基因提供了技术借鉴。
[0014] 更详细的技术方案见《【具体实施方式】》所述。
【附图说明】
[0015] 序列表SEQ ID NO: 1是分离克隆的化化ls2主效基因的等位基因（编号hapl)的 核巧酸序列，序列全长为1455bp ;其中；1-64位和1112-1455位是外显子区域，内含子区域 为65-1111位，其编码135个氨基酸。其中CDS区为1-64位和1112-1455位，TGA为终止 子。
[0016] 序列表SEQ ID N0:2是分离克隆的化化ls2主效基因(编号hap2)的核巧酸序列， 序列全长为1378bp ;编码109个氨基酸。其中；CDS区为1-64位和1113-1378位，TAA为终 止子。在该主效基因中，1-64位和1113-1378位为外显子区域；内含子区域为65-1112位 区域。
[0017] 序列表SEQ ID NO:3是拼接的化化ls2主效基因的等位基因（hapl)的CDS区，序 列全长为408bp，编码135个氨基酸序列。
[001引序列表SEQ ID N0:4是化化ls2主效基因的等位基因（hapl)的蛋白质的序列。
[0019] 序列表SEQ ID N0:5是拼接的化化ls2主效基因（编号hap2)的CDS区，序列全长 为33化P，编码109个氨基酸序列。
[0020] 序列表SEQ ID N0:6是化化ls2主效基因的蛋白质的序列。
[0021] 图1.用于深度测序的材料在aus中的表型分析。发现两年的重复试验结果表明： aus中的两种单倍形材料在SPAD、ch化、chla/ch化表型中存在显著差异，而chla及total chi也在一年中检测到了显著差异(分别见图1A-1D)。
[0022] 图2.用于深度测序的材料在ind中的表型分析。发现两年的重复试验结果表明， ind 中 hap2 及 hap5 与 hapl 单倍型材料在 SPAD、chla、ch化、chla/ch化及 total chi 表型 中存在显著差异(分别见图2A-2E)。
[0023] 图3.化化ls2基因在水稻hap2和hapl中表达水平示意图。取ind的四种单倍型 材料，做表达量检测，发现hap2及hap5的表达量极显著低于hapl。
[0024] 图 4.原始质粒 PCAMBIA1301。
[0025] 图5.本发明构建的超量表达质粒