产醛酮还原酶菌株、基因、酶、载体、工程菌及应用
【专利说明】产酵酬还原酶菌株、基因、酶、载体、工程菌及应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种产醒酬还原酶Canidia a化icans筛选、醒酬还原酶基因克隆和上 述酶基因重组表达载体及重组菌构建，并开发醒酬还原酶及其重组菌在阿托伐他汀手性中 间体6-氯基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋生物催化合成方面的应用。 (二）【背景技术】
[0002] 屯、脑血管疾病已经成为危害人类身体健康的头号杀手，预计到2020年，屯、血管疾 病死亡人数将占人类总死亡人数的36%。在屯、脑血管疾病一级和二级预防中，他汀类药物 (Statin)能有效抑制胆固醇合成、显著降低屯、脑血管疾病的事件，已成为动脉粥样硬化疾 病治疗的基础药物。2006年，仅阿托伐他汀的销售额达到136亿美元。IMS发布2009年 全球药物销售数据，阿托伐他汀累计销售额高居世界畅销药品首位。HMG-CoA还原酶催化 HMG-CoA还原成3-甲基-3, 5-二哲基戊酸，是胆固醇生物合成途径的限速酶。他汀类药物 能竞争性抑制HMG-CoA还原酶活性，抑制胆固醇的生物合成。阿托伐他汀是全合成的高效 他汀类药物，0，5-二哲基戊酸是关键的活性结构。阿托伐他汀高效抑制肝脏胆固醇合成， 促进肝脏低密度脂蛋白（LDL)受体增加、改变极低密度的脂蛋白颗粒形成。阿托伐他汀在 10~80毫克/天剂量范围内降低低密度脂蛋白胆固醇水平41~61 %，降低高甘油S醋血 症患者血清甘油=醋水平43%。此外，他汀类药物对胆固醇高或者不高、且无屯、脑血管疾病 的人群提供非常好的屯、血管保护作用，帮助合并糖尿病和高血压的患者合理控制胆固醇水 平，标准治疗剂量的他汀可获得非常明显的保护作用。
[0003] 6-氯基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋是阿托伐他汀的关键手性合成子。由 于各国药监部口对药物手性纯度要求严格（e.e.值>99.5%，d.e.值>99 % ) ,6-氯 基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋的合成技术成为阿托伐他汀合成的关键核屯、技术。传统的 6-氯基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋化学合成工艺从酬酸或者酬醋类化合物出发，通过不 对称合成构建手性中屯、，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的棚烧、正了基裡和深冷等特殊 环境，从而导致产物d.e.值低、得率低，能耗大。而且，反应产生的棚化物废物处理困难，需 要经过繁琐的甲醇泽灭、真空蒸馈的反复处理。酶具有优异的选择性，反应过程条件温和， 一般在常温、常压及近中性条件下即可进行，从而把分解、异构化、外消旋化、重排等不利副 反应降到最低限度，基于酶催化的生物合成技术具有过程原子经济性高、反应过程绿色环 境友好的优势。因此，开发生物不对称还原6-氯基-巧时-哲基-3-幾基己酸叔了醋合成 6-氯基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋技术，具有巨大的经济、社会和环境效益。 (H)
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种立体选择性醒酬还原酶产生菌一一白假丝酵母（Canidia a化icans)，1条来自Canidia a化icans醒酬还原酶基因序列、含有上述基因的重组载 体及其转化得到的重组基因工程菌，并开发醒酬还原酶工程菌细胞及其纯化酶在6-氯 基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋生物催化合成方面的应用。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种醒酬还原酶基因，所述醒酬还原酶基因的核巧酸序列为SEQ ID No. 1所示，命名为ca-7,全长为93化P。其中，其编码序列（CD巧为；从第一个核巧酸起至 第930个核巧酸止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG,该条序列无内含子。
[0007] 本发明所述的重组醒酬还原酶基因来源于环境中分离得到的白假丝酵母 (Canidia a化icans)XP1463,保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏日期为2014年8月14 日，保藏编号为CCTCC No ;M 2014382,保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
[000引本发明所述的醒酬还原酶基因可W从Canidia a化icans XP1463基因组中克隆获 得，也可W从该醒酬还原酶基因的重组载体中或者重组菌中克隆，也可W人工合成。
[0009] 由于核巧酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO. 1所示的多核巧酸的突变体，只要其与 该多核巧酸具有90% W上的同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核巧酸的突变体 是指一种具有一个或多个核巧酸改变的多核巧酸序列，此多核巧酸的突变体可W是自然发 生的等位突变或非自然发生的突变，包括取代突变、缺失突变和插入突变，如本领域所知的 同义突变，由一个或多个核巧酸的取代，但不会实质性地改变其编码的多肤链的功能。
[0010] 本发明还提供一种所述醒酬还原酶基因编码的醒酬还原酶，所述醒酬还原酶的氨 基酸序列为SEQ ID No. 2所示。
[0011] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多肤的片段 及其突变体，如其保守性突变、生物活性片段或衍生物，只要该多肤的片段或多肤突变体与 前述氨基酸序列同源性在95% W上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括 氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换。
[0012] 本发明还设及一种所述醒酬还原酶基因构建的重组表达载体。本发明所述的重组 表达载体可W通过本领域常规方法将本发明的醒酬还原酶基因连接于各种表达载体上构 建而成。所述的载体可W为本领域常规的各种载体，如商品化质粒（大肠杆菌中合适的载 体有 PLG338、PACYC184、PBR322、pUC18、pUC19、地C30、祀T20、祀T32、pR巧4、抑S1、P服2、 pM化等）、粘粒（PHZ132)、瞻菌体或者病毒载体（反转录病毒载体，腺病毒载体）等。所述质 粒代表部分质粒，其他质粒为本领域中的普通技术人员所公知。本发明所述重组载体优选 祀T28a质粒。可W通过下述方法制得本发明的重组表达载体；WCanidia a化icans XP1463 基因组DM为模板，通过上游引物（引物1) ;5' - CATATGACTTCACATACCCATCCTGTTA-3'，下 游引物（引物2)5' -GCGGCCGCCTATAAATCTTTAAATGCTT-3^进行PCR扩增所得到的醒酬还原 酶基因产物（核巧酸序列为SEQ ID NO. 1)，与pGEM-T Easy载体连接，所得重组载体pGEM-T Easy-ca-7用限制性内切酶Nde I和Not I双酶切，形成的醒酬还原酶基因粘性末端分别与 表达载体祀T28a经相同限制性内切酶双酶切产物用T4DNA连接酶连接，生成含有本发明的 醒酬还原酶基因片段的重组表达载体祀T28a-ca-7。
[0013] 本发明提供一种由所述重组表达载体转化得到的携带醒酬还原酶基因的重组基 因工程菌，通过将本发明的重组表达载体转化至宿主E.coli化2UDE3)中制得。所述的宿 主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体稳定的自行复制， 且所携带的醒酬还原酶能被有效表达即可。本发明优选E.coli化21 0E3)，将本发明前述 的表达质粒祀T28a-ca-7通过常规转化方法转化至E. coli BL2UDE3)中，即可得本发明优 选的基因工程菌株 E. coli BL2UDE3)/pET28a-ca-7。
[0014] 本发明设及一种所述醒酬还原酶基因在制备重组醒酬还原酶中的应用，具体所述 的应用为；构建含有所述醒酬还原酶基因的重组载体，将重组载体转化至宿主菌中，优选 E. coli化21 0E3)，获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液经固液分离，获得含重组醒酬 还原酶的菌体细胞。所述的诱导培养所用的培养基可为本领域任何可使菌体生长并合成本 发明的醒酬还原酶的培养基，优选LB培养基；蛋白腺lOg/l，酵母膏5g/L，化C1 lOg/l，溶 剂为水，pH 7.0。培养方法和培养条件无特殊要求，培养方法和条件可W根据宿主类型和 培养方式等按照本领域普通知识进行选择，能使构建的工程菌生长并表达本发明所述的醒 酬还原酶即可。优选下述方法；将本发明设及的重组菌接种至含终浓度为50 y g/mL卡那 霉素的LB培养基中培养，当培养基光密度ODe。。达到0. 8~1. 0 (优选1. 0)时，在终浓度为 1. 0~15. Og/L(优选9. Og/L)乳糖的诱导下，高效表达本发明的重组醒酬还原酶。
[0015] 此外，本发明还提供一种所述醒酬还原酶基因编码的醒酬还原酶在催化6-氯 基-巧时-哲基-3-幾基己酸叔了醋不对称还原中的应用。具体所述的应用为；W携带醒酬 还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞或将菌体细胞经超声破碎后的破碎 液离屯、所获得的上清液为催化剂，W 6-氯基-巧时-哲基-3-幾基己酸叔了醋为底物，W葡 萄糖为辅助底物（W葡萄糖为辅助底物时，在菌体葡萄糖脱氨酶催化作用下将菌体内源性 氧化型NAD任)+还原成NAD (巧H，NAD (P)H作为氨供体参与还原反应）或者直接添加外源性 还原型NADH作为底物，W抑7. 0磯酸钟缓冲液为反应介质构成反应体系，在30°C、200转/ 分钟条件下进行转化反应，反应完全后，获得含6-氯基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋的混 合液，将混合液分离纯化，获得6-氯基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋；所述底物的初始浓 度为0. 01~0.1mol/L反应体系（优选0. 05mol/L)，所述催化剂的用量W菌体细胞湿重计 为50~300g/L反应体系（优选200g/L)，所述葡萄糖的用量为1~50g/L反应体系（优 选5g/L)，所述NADH的用量为0. 01~0.1mol/L反应体系（优选0. 02mol/L)。制备的样品 6-氯基-(3R, 5R)-二哲基己酸叔了醋d. e.值大于90%，分离收率89. Owt%。
[0016] 本发明W菌体细胞为催化剂制备6-氯基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋时，所述 的应用为；W携带醒酬还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞为催化剂， W 6-氯基-巧时-哲基-3-幾基己酸叔了醋为底物，W葡萄糖为辅助底物，W抑7. 0磯酸 钟缓冲液为反应介质构成反应体系，在30°C、200转/分钟条件下进行转化反应，反应完全 后，获得含6-氯基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋的混合液，将混合液分离纯化，获得6-氯 基-(3R，5R)-二哲基己酸叔了醋；所述底物的初始浓度为0. 01~0.1mol/L反应体系（优 选0.05mol/L)，所述催化剂的用量W菌体细胞湿重计为50~300g/L反应体系（优选200g/ L)，所述葡萄糖的用量为1~50g/L反应体系（优选5g/L)。
[0017] 本发明所述反应体系包括下列两种；（1) W携带醒酬还原酶基因的重组工程菌经 发酵培养获得的菌体细胞为催化剂，W 6-氯基-巧时-哲基-3-幾基己酸叔了醋为底物，W 葡萄糖为辅助底物，W抑7. 0磯酸钟缓冲液为反应介质构成反应体系；（2) W携带醒酬还原 酶基因的重组工程菌发酵液分离的菌体经超声破碎后的破碎混合液离屯、获得的上清液为 催化剂，W 6-氯基-巧时-哲基-3-幾基己酸叔了醋为底物，添加外源性还原型NAM1构成 反应体系。
[001引进一步，所述催化剂为菌体细胞经超声破碎后的破碎混合液离