5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的环式重排变体和互补片段对的制作方法
【专利说明】5-婦醇式丙鋼醜-莽草酸-3-磯酸合酶的环式重排变体和 互补片段对 发明领域
[0001] 本发明涉及5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶的环式重排变体和互补片段 对，及生成和使用它们的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶（EPSPS)是真菌、细菌、藻类、高等植物及 寄生于脊椎动物上的寄生虫顶覆虫体内芳香族氨基酸合成途径（即莽草酸合成途径）中一 个关键酶，它催化一分子的莽草酸-3-磯酸（S3P)和磯酸帰醇式丙丽酸（阳P)生成5-帰醇 式丙丽酸莽草酸-3-磯酸（EPSP)。莽草酸合成途径产物除参与芳香族氨基酸如苯丙氨酸、 酪氨酸、色氨酸等的合成W外，还参与植物体内一些生物碱、香豆素、类黄丽、木质素、剛巧 衍生物、酷类物质等的次生代谢，形成的植物组分占植物干重的大约35%甚至更多。
[0004] 草甘麟，即N-麟醜甲基甘氨酸，是一种广谱、高效的发芽后除草剂。草巧麟一经施 用后能被植物迅速吸收，并随其同化产物传导至整个植株，阻断EPSP的合成和运输，它是 EPSPS合成底物PEP的竞争性抑制剂，可阻断阳P和S3P该两种底物在EPSPS的催化下向 EPSP的转化，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，因此对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、 呼吸W及蛋白质等代谢过程产生影响而导致植物死亡。
[0005] 环式重排（circular permutation, CP)是一种重要的蛋白质定向进化分析的手 段。蛋白质的环式重排是将蛋白质的一级序列进行重排，比如说在将一个特定位点的N端 移动到该个特定位点C端的C端，即使得原来该点的C端成为了新的蛋白质变异体的N端， 该点的原来的N端成为新蛋白变异体的C端。一般来说新的N端和C端之间要加一个柔初 性较好的接头，促进新蛋白质的折叠。简单来说相当于用一个接头将蛋白质原来的N端和 C端相连，然后在蛋白质的内部某一个位点"剪开"，产生新的N端和C端巧日图1所示)。
[0006] 在自然界中已经发现了一些蛋白质环式重排变异体，产生机制一般有两种类型， 分别是复制/删除机制W及分裂融合机制。对于前者来说，一个基因发生了水平串联复制， 然后在N端和C端发生了任意剪切，造成了环式重排变异体的形成。对于后者来说，一个已 有的蛋白的分裂产生了两个蛋白结构域或者蛋白质的片段，它们直接的重新融合产生了新 的环式重排变异体。该些新的蛋白质重排变异体大多数依旧可W折叠成与天然蛋白质类似 的H维结构，所W依旧拥有与天然蛋白质类似的功能。当然该些变异体一般情况下活力不 如原来的母体，个别可能拥有更高的活力，但是该些变异体经常会拥有一些特殊功能，比女口 说对蛋白酶裂解的敏感性降低、识别更广谱的底物或者配体、更高的热稳定性，所W近年来 环式重排作为一种改造蛋白质特性的手段得到了研究人员越来越多的关注。
[0007] 蛋白质片段互补，1957年化chards发现，用蛋白酶裂解核糖核酸酶A后得到两个 只有很少酶活性的肤链一S蛋白和S肤链，将两者混合在一起可W恢复其核糖核酸酶的活 性，该被称之为蛋白重建（protein reconst;Uution)。后来，人们又发现许多蛋白可W由其 两个或两个W上的片断成功重建，该些片断既可W由蛋白酶消化产生，也可W通过基因表 达的方法生成，例如葡萄球菌的核酸酶、色氨酸抑制子等。该些可W拆分的蛋白无论大小都 可能包含一个W上的能成功使蛋白重建的分拆位点，如氨醜tRNA合成酶有939个氨基酸， 含有至少八个该样的分拆位点。
[0008] 用于蛋白重建的片段通常包括整个结构单元或者超二级结构域。蛋白能够重建表 明该蛋白至少可W在两个二级结构之间的片段区域中的共价键断开后仍旧保持一定的片 段稳定性，而蛋白内的非共价作用则十分特殊，从而使片段有利于向天然的结构靠塊，却不 形成其它的异变结构。在生物进化过程中，该类蛋白中使其形成天然结构的非共价作用被 极大的优化，从而利于形成天然的结构元件或亚结构域。因此无论是一个完整的肤链还是 两条肤链，两个没有共价键相连的亚结构域可W自发的形成天然的蛋白结构。
[0009] 蛋白质的片段互补已经被用作研究结构域排列的工具，也被用作研究早期折叠中 间态的模型。结合定点突变的蛋白重建可W用来评价单个氨基酸侧链对蛋白稳定性的影 响，结合瞻菌体展示可W确定两个片段之间起主要相互作用的位点。重建的蛋白并非一旦 结合就永不分开，其片段在形成复合体和解离成单独的片段之间形成动态平衡，该种平衡 的偏移方向取决于片段之间作用力的强弱。
[0010] 最新的研究表明，大肠杆菌的EPSPS也可W由片段天然互补重建其酶活性。把其 基因在218/219氨基酸位点分拆为两段后，编码出的两个片段在aroA缺陷的大肠杆菌菌株 体内可W互补其EPSPS活性；将该两个片段分别表达，其单体大多W包含体形式存在，把纯 化的包含体共复性，就可W互补重建EPSPS活性。说明大肠杆菌的EPSPS无论在体内还是 体外，均能通过片段互补重建其活性。
[0011] 片段互补可W有效的解决抗草甘麟EPSPS转基因植物扩散的问题，比如将EPSPS 的N端编码基因加上叶绿体定位肤编码基因在植物细胞核染色体中表达，而将C端编码基 因在叶绿体中表达。单独一个基因表达产生的片段都不具有EPSPS的活性，因此即使扩散 到了外界环境，也没有选择优势。而当N端片段表达出后，在定位肤的作用下被运输到叶绿 体，和C端片段互补重组EPSPS活性。如果片段互补的EPSPS突变后具有较高的草巧麟耐 受性，把其分别转入植物的染色体基因组和叶绿体基因组，植物就可W获得草巧麟耐受性。
[0012] 但是问题在于，许多结构刚性比较强的蛋白很难找到能够直接发生天然互补的位 点，或者说即使可W发生天然互补，效率也比较差。一个潜在的解决方案在于将两个片段分 别与可W发生相互作用的两个蛋白质或者可W发生二聚化的结构域融合，通过蛋白质的相 互作用或者结构域二聚化使得两个天然无法互补的片段在空间上接近，提高它们相互作用 时的浓度，该样就很有可能将帮助两个片段进行互补。但是同样的基于该种方法的位点也 不是随机选取的，而且前人的研究成功的实例或多或少都带有一定的经验成分，所W建立 一种确定该位点的有效方法很重要。我们实验中建立了将环式重排的位点作为辅助获得蛋 白质片段互补的位点的体系。因为环式重排本质上是利用的短的接头，将蛋白质两个片段 直接连在一起，使其在空间上靠近，折叠成天然的活性蛋白质。而蛋白质相互作用辅助的片 段互补技术是通过蛋白质的相互作用将两个不能天然互补的片段在空间上拉近，使其恢复 天然蛋白质的活力，因此两者之间有内在的联系，我们认为环式重排的研究是很好的蛋白 质片段互补系统研究的基础。
[001引发明概述
[0014] 一方面，本发明涉及5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶的环式重排变异体， 其从N端到C端W B-L-A表示，其中L代表接头，A代表5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸 合酶全长氨基酸序列N端至第P位的氨基酸区段，B代表5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯 酸合酶全长氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸区段。在一个实施方案中，其中所述5-帰 醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶为大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶。 在进一步的实施方案中，所述大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶如序列1所 示。在进一步的实施方案中，P 选自 71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、 300、328、342、358、359、360、361、362、363 和 364。在进一步的实施方案中，口选自110、145、 215、229、300、328和362。在另一个实施方案中，在所述5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯 酸合酶不是序列1所示大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶的情况下，P为 与序列1所示大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶第71、82、110、136、145、 160、185、215、229、234、240、268、300、328、：342、358、359、360、361、362、363 或 364 位对应 的位置。在进一步的实施方案中，P为与序列1所示大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草 酸-3-磯酸合酶第110、145、215、229、300、328或362位对应的位置。在一个实施方案中， L 为（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 接头。
[0015] 另一方面，本发明涉及5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶的互补片段对，其 中第一片段从N端到C端W E-L1-A表示，第二片段从N端到C端W F-L2-B表示，其中E 和F代表相同或不同的二聚化肤，L1和L2代表相同或不同的接头，A代表5-帰醇式丙丽 醜-莽草酸-3-磯酸合酶全长氨基酸序列N端至第P位的氨基酸区段，B代表5-帰醇式丙 丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶全长氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸区段，其中当E和F相 同时发生同二聚化，或者当E和F不同时发生异二聚化。在一个实施方案中，所述5-帰醇 式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶为大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶。在 进一步的实施方案中，所述大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶如序列1所示。 在进一步的实施方案中，P 选自 71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、300、 328、342、358、359、360、361、362、363 和 364。在进一步的实施方案中，口选自110、145、215、 229、300、328和362。在另一个实施方案中，在所述5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合 酶不是序列1所示大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶的情况下，P为与序列 1所示大肠杆菌5-帰醇式丙丽醜-莽草酸-3-磯酸合酶第71、82、110、136、145、160、185、 215、229、2：34、240、268、300、328、342、358、359、360、361、362、363 或 364 位对应的位置