素分子内 部脱除甲壳素上的己酷氨基，制备低分子量壳聚糖，该方法污染小，反应温度低，操作简单， 且容易生产。该方法中用1%的己酸溶解壳聚糖，然后调节抑=7.0后析出的壳聚糖，其脱己 酷度比较均匀。
[0019] (4)将步骤（3)中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装后，采用福照灭菌， 用灭菌计量为16 KGY，灭菌5 h，得到低分子量壳聚糖敷料产品。
[0020] 该低分子量壳聚糖敷料的抗菌试验表明；对大肠杆菌的抑菌率为91. 5%，对金黄 色葡萄球菌的抑菌率为92. 4% ;动物试验(大白兔）结果显示；该低分子量壳聚糖敷料具有 很好的生物相容性，喷洒在大白兔伤口处可W快速止血，止血时间为5 min,-段时间后，大 白兔伤口无红肿、斑点等致敏性现象出现，伤口处无感染、溃烂等情况发生，细胞无毒性，细 胞形态正常，无过敏现象。
[0021] 实施例2 (1)南极磯邮在4°C解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只邮，称取捣碎后的组织液 lOOg放入发酵罐中，在发酵罐中接种体积分数为10%的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS 培养基，发酵的初始抑为7. 5,发酵的温度为45 °C，发酵时间为96 h，发酵结束后，过滤滤 液，收集滤渣，并用蒸馈水多次冲洗滤渣，去除蛋白质、乳酸巧、邮青素等杂质，冲洗至无色 后烘干滤渣。
[0022] (2)将步骤（1)中得到的滤渣和碱质量浓度为25%的化0H溶液按质量体积比为W/ V=1 ;15混合均匀后，在80°C条件下超声波处理12 h。
[002引（3)超声结束后，用酸性溶液为4 mol/L的肥1溶液将混合液调至中性，然后用蒸 馈水反复冲洗多次，将洗净后的固体物溶解在体积浓度为1%的己酸中，滤去不溶物，收集 滤液，并用碱液调节滤液抑=7. 0后，静置1 h，再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馈水清 洗固体物后烘干、粉碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖固体粉末。此方法得到的低 分子量壳聚糖的分子质量为5000 Da、脱己酷度为85%。
[0024] (4)将步骤（3)中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装后，采用福照灭菌， 用灭菌计量为25 KGY，灭菌7 h，得到低分子量壳聚糖敷料产品。
[0025] 该低分子量壳聚糖敷料的抗菌试验表明；对大肠杆菌的抑菌率为97. 9%，对金黄 色葡萄球菌的抑菌率为98. 3% ;动物试验(大白兔）结果显示；该低分子量壳聚糖敷料具有 很好的生物相容性，喷洒在大白兔伤口处可W快速止血，止血时间为2 min,-段时间后，大 白兔伤口无红肿、斑点等致敏性现象出现，伤口处无感染、溃烂等情况发生，细胞无毒性，细 胞形态正常，无过敏现象。
[0026] 实施例3 实验组： (1)南极磯邮在4°C解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只邮，称取捣碎后的组织液 lOOg放入发酵罐中，在发酵罐中接种体积分数为10%的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS 培养基，发酵的初始抑为7. 0,发酵的温度为42 °C，发酵时间为72 h，发酵结束后，过滤滤 液，收集滤渣，并用蒸馈水多次冲洗滤渣，去除蛋白质、乳酸巧、邮青素等杂质，冲洗至无色 后烘干滤渣。
[0027] (2)将步骤（1)中得到的滤渣和质量浓度为20%的化0H溶液按质量体积比为W/ V=1 ;1〇混合均匀后，在65°C条件下超声波处理8 h。
[002引（3)超声结束后，用4 mol/L的肥1溶液将混合液调至中性，然后用蒸馈水反复冲 洗多次，将洗净后的固体物溶解在体积浓度为1%的己酸中，滤去不溶物，收集滤液，并用碱 液调节滤液抑=7. 0后，静置45 min,再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馈水清洗固体物 后烘干、粉碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖固体粉末。此方法得到的低分子量壳 聚糖的分子质量为7500 Da、脱己酷度为80%。
[0029] (4)将步骤（3)中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装后，采用福照灭菌， 用灭菌计量为20 KGY，灭菌6 h，得到低分子量壳聚糖敷料产品。
[0030] 对照组1 ;将实施例3的实验组步骤（1)中的试验对象南极磯邮替换为南美白对 邮，作为对照组1，其他处理过程均按照实施例3中实验组的步骤（1) (2)、（3) (4)进行； 按照上述方法制备的对照组1的壳聚糖的分子质量为7900 Da,脱己酷度为75%。
[0031] 对照组2 ;将实施例3的实验组步骤（1)中采用的乳酸菌发酵法替换为采用化学 法(酸碱法)制备，即；南极磯邮在4°C解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎整只邮，称取捣碎后 的组织液lOOg放入烧杯中，先加入500 mL质量浓度为6%的肥1溶液在30°C浸泡2 h脱 矿物质，期间每隔15 min揽拌一次，然后过滤滤渣，并用蒸馈水反复清洗滤渣多次，再加入 500血质量浓度为8%的化0H溶液在90°C条件下脱蛋白2 h，期间每隔15 min,揽拌一次， 然后过滤滤液，收集滤渣，并用蒸馈水多次冲洗滤渣，并烘干滤渣。其余过程均按照实施例 3中实验组的步骤（2)、（3)、（4)进行；按照上述方法制备的对照组2的壳聚糖的分子质量 为7300 Da,脱己酷度为81%。
[0032] 对照组3 ;将实施例3的实验组步骤（2)中采用低浓度碱液制备步骤替换为采用高 浓度碱液制备，即；由实施例3的实验组步骤（1)中得到的滤渣和碱质量浓度为45%的化0H 溶液按质量体积比为W/V=l ;10混合均匀；其他过程均按照实施例3中实验组的步骤（1)、 (2)、（3)、（4)进行；按照上述方法制备的对照组3的壳聚糖的分子质量为7200 Da,脱己酷 度为87%。
[0033] 对实验组和对照组中的壳聚糖敷料进行抗菌试验和动物试验，其实验结果如下所 示：
【主权项】
1. 一种低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下： (1) 南极磷虾在4°C解冻后，通过组织捣碎机进行捣碎，将捣碎后的组织液放入发酵罐 中，在发酵罐中接种体积分数为10%的活化后的乳酸菌，活化培养基为MRS培养基，发酵的 初始pH为6. 0~7. 5,发酵的温度为37~45°C，发酵时间为48~96h，发酵结束后，过滤滤液，收 集滤渣，并用蒸馏水多次冲洗滤渣，去除杂质，冲洗至无色后烘干滤渣； (2) 将步骤（1)中得到滤渣和碱液按W/V=l :5~1 :15混合均匀后，在50~80°C条件下超 声波处理4~12 h ; (3) 超声结束后，用酸性溶液将混合液调至中性，然后用蒸馏水反复冲洗多次，将洗 净后的固体物溶解在体积浓度为1%的乙酸中，滤去不溶物，收集滤液，并用碱液调节滤液 pH=7.0后，静置0.5~1 h，再次过滤出滤液析出的固体物，用蒸馏水清洗固体物后烘干、粉 碎、过筛，得到粉末状的低分子质量壳聚糖； (4) 将步骤（3)中得到的粉末状的低分子质量壳聚糖进行包装、灭菌，即得低分子量壳 聚糖敷料。
2. 根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (2) 中的碱液的质量浓度为15% ~ 25%，所述的碱液为NaOH溶液或KOH溶液。
3. 根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (3) 中的酸性溶液为4 mol/L的HCl溶液。
4. 根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (3) 中的碱液为0· I mol/L的NaOH溶液。
5. 根据权利要求1所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于，所述的步骤 (4) 中的灭菌方法为辐照灭菌，灭菌剂量为16~25 KGY，灭菌时间为5~7 h。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的低分子量壳聚糖敷料的制备方法，其特征在于， 所述的低分子量壳聚糖的分子量为5000~10000 Da，脱乙酰度为70%~85%。
【专利摘要】本发明属于医用壳聚糖敷料领域，具体涉及一种低分子量壳聚糖敷料的制备方法。低分子量壳聚糖敷料的制备方法分为以下几个步骤：（1）以南极磷虾为原料，通过乳酸菌发酵法制备甲壳素；（2）通过碱液结合超声波技术脱除甲壳素上的乙酰基制备壳聚糖；（3）乙酸纯化提取低分子量壳聚糖；（4）用低分子量壳聚糖粉末制备低分子量壳聚糖敷料。本发明的制备方法可以大大减少酸碱对环境的污染，同时本发明选用南极磷虾利用微生物发酵和超声波技术制备得到的低分子质量壳聚糖及其敷料具有更好的抗菌、止血效果，且减少了过敏反应，可以在伤口擦伤、大量出血时，喷洒该敷料即可有效的发挥止血作用。
【IPC分类】A61L15-46, C12P19-26, A61L15-28
【公开号】CN104630313
【申请号】CN201510054978
【发明人】卢亢, 陈泽楚, 李婷, 陈锦涛
【申请人】广东泰宝医疗科技股份有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月3日