一种突变的tbc1d1蛋白信号分子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种突变的TBC1D1蛋白信号分子及其应用，具体 而言，利用基因组编辑技术或者通过化学物质解除动物体内代谢调控因子TBC1D1特定位 点的磷酸化状态，使得TBC1D1蛋白功能改变，从而达到改变动物代谢、提高其生长速度、饲 料利用率的目的。
【背景技术】
[0002] 提高家禽或家畜的生长速度、饲料利用率和瘦肉含量一直是畜牧业关注的重要问 题，也是传统育种长期努力的目标。目前，在畜牧业内采取了很多方法提高生长速度和饲料 的利用率。其中比较常用的方法是在饲料中添加抗生素或类似化学制剂，但由于抗生素或 化学制剂的药物残留较高，增加向环境和其他物种传播抗性的风险，因而抗生素的使用以 及其带来的经济效益都在日渐降低。另一种方法就是体外注射生长激素（GH)制剂。这类 制剂在血内的半衰期较短，需要长期注射才能达到效果，对使用技术要求比较高，而且要严 格控制注射剂量以避免GH的毒副作用。以上原因也是GH在畜牧业生产条件下大规模实施 限制因素。人们也尝试注射另一种激素，生长激素释放因子（GHRF)，或者表达GHRF的DNA 质粒来促进家禽和家畜生长，这个方法取得了很好的效果。GHRF是一种由下丘脑分泌的肽 激素，可以促进GH的释放和合成，增加内源性的GH含量。但这种处理方法同样需要长期注 射。而且外源蛋白进入机体后还会引起机体免疫应答反应，也不适用于畜牧业生产。
[0003] 近年来随着现代生物技术的发展，为提高饲料效率、生长速度和瘦肉比例，分子育 种方法被广泛应用于畜牧业新品种的培育上，这些新技术的应用极大缩短了传统育种的周 期，并使得新品种培育的品质定向性更强，例如在已获得授权的专利CN100435848C中就提 及了这样一种方法。该专利通过转基因技术在动物体内过量表达编码GHRF(生长激素）信 号肽的GHRFcDNA序列，从而使GHRF信号肽在动物体内的表达维持在一定水平上。利用这 项技术培育出的新品种实现了饲料的高效利用、动物的生长加快以及减少动物脂肪积累的 功能。但是这项专利技术除了在动物体内持续表达GHRFDNA序列的同时还引入了编码抗 生素抗性基因的DNA序列，这种转基因动物的潜在风险尚没有明确的评估标准，即使没有 任何危害，公众对转基因食品的接受程度也比较低，这大大限制了这种转基因新品种在畜 牧业生产上的推广。
[0004] 众所周知，动物的生长速度、饲料利用率和瘦肉含量与代谢都有极大的关系。蛋 白激酶AMPK是身体内重要的能量感受器，是糖脂和能量代谢的重要调控因子，可通过 磷酸化下游TBC1D1蛋白调控骨骼肌糖代谢。TBC1D1蛋白是一种RabGTPase激活蛋白 (RabGAP)，在氮端有两个磷酸化酪氨酸结合结构域（phospho-tyrosinebindingdomain， PTB)，而在碳端有一个GAP结构域（图1所示），TBC1D1蛋白可以通过其GAP活性调控 下游的Rab蛋白，进一步调控骨骼肌中四型葡萄糖转运体的细胞质膜转移过程，而这是骨 骼肌中葡萄糖吸收的一个关键调控步骤。另有研宄表明TBC1D1蛋白参与脂肪代谢的调 控。在人类中，TBC1D1蛋白上的突变与家族性女性肥胖症有关（TBClDlisacandidate forasevereobesitygeneandevidenceforagene/geneinteractioninobesity predisposition.StoneS,etal. 15, 2709-27202006,HumanMolecularGenetics)。Chen S,MurphyJ,TothR,CampbellDG,MorriceNA,MackintoshC.等人在Complementary regulationofTBClDlandAS160bygrowthfactors,insulinandAMPKactivators这篇 文章（TheBiochemicaljournal409,449_459,2008)中公开了在小鼠TBC1D1 蛋白氛基酸 序列的231位点上的丝氨酸（Ser)如图1所示，已被证明可以被上游激酶磷酸化，这一位点 磷酸化也对葡萄糖转运以及脂代谢有重要的调控作用。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术不足，通过基因编辑技术，使TBC1D1蛋白功能序列磷酸化状 态发生变化，从而改变蛋白功能，使得机体在同样摄食量的情况下快速生长。
[0006] 本发明具体技术方案如下： 一种突变的TBC1D1蛋白信号分子，其保守区域氨基酸序列如SEQID:N0 1所示。
[0007] SEQID:NO1RKSFAQPGLRS TBC1D1蛋白信号分子是一种广泛分布的蛋白分子，在很多物种中都存在，其蛋白结构 包含有N端的两个PTB和C端的GAP结构域。在TBC1D1的氨基酸序列中，如SEQID:N0 2 所示的氨基酸序列在不同物种中高度保守（如图2所示），例如小鼠（ID:NP_062610. 2)的 保守区域位点为TBC1D1氨基酸序列的227到237位氨基酸，大鼠（ID:XP_006251066. 1)的 保守区域位点为TBC1D1氨基酸序列的227到237位氨基酸，猪（ID:XP_005666634. 1)的保 守区域位点为TBC1D1氨基酸序列的190到200位氨基酸，牛（ID:XP_611974)的保守区域 位点为TBC1D1氨基酸序列的230到240位氨基酸，羊（ID:XP_005681554. 1)的保守区域 位点为TBC1D1氨基酸序列的230到240位氨基酸，狗（ID:XP_536262)的保守区域位点为 TBC1D1氨基酸序列的256到266位氨基酸，鸡（NP_001254502. 1)的保守区域位点为TBC1D1 氨基酸序列的253到263,鸭（ID:XP_005029721. 1)的保守区域位点为TBC1D1氨基酸序列 的252到262,猴（ID:XP_005554711. 1)的保守区域位点为TBC1D1氨基酸序列的233到243 位氨基酸，人的TBC1D1蛋白信号分子（NP_055988. 2)的保守区域位点为TBC1D1氨基酸序 列的233到243位氨基酸。
[0008] SEQID:N0 2RKSFSQPGLRS 与SEQID:N0 2相比，本发明保护的突变的TBC1D1蛋白信号分子，其保守区域氨基酸 序列中的丝氨酸（S)改变为丙氨酸（A)，从而使该保守区域不能够被磷酸化。
[0009] 本发明还提供了上述突变的TBC1D1蛋白信号分子在提高生物体生长速度和饲料 利用率的应用。
[0010] 本发明还提供了一种提高生物体生长速度、提高饲料利用率的方法，其特征在于 利用基因组编辑技术或者通过化学物质解除或阻断生物体代谢调控因子TBC1D1蛋白信号 分子磷酸化状态，使得TBC1D1蛋白功能改变。优选的，将TBC1D1蛋白信号分子的保守区域 SEQID:N0 2所示的氨基酸序列中的丝氨酸非磷酸化。
[0011] 优选的，可以将丝氨酸改变为不能被磷酸化的其他氨基酸。在本发明的一个优选 方案中，将丝氨酸改变为丙氨酸，得到保守区域氨基酸序列如SEQID:N0 1所述的TBC1D1 蛋白信号分子。
[0012] 上述方法中，可以利用同源重组、锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应物核酸酶 术或者规律性成簇间隔短回文重复CRISPR/Cas系统，使TBC1D1蛋白信号分子基因组DNA 外显子上编码TBC1D1蛋白信号分子的保守区域SEQID:NO2所示的氨基酸序列的基因序 列发生改变。
[0013] 本发明的一个优选的方案中，通过同源重组基因打靶的方法在小鼠体内将TBC1D1 基因组DNA序列中编码TBC1D1氨基酸序列231位点丝氨酸的TCA变为编码丙氨酸的GCA，使 得TBC1D1蛋白序列231位点中的磷酸化的丝氨酸位点（……KSF)pS(QPG……）变为（…… KSF)A(QPG……），使得这个位点由原来可以被磷酸化的状态改变为不能再发生磷酸化。小 鼠出生后经过PCR鉴定筛选出阳性小鼠，即携带有TBC1D1蛋白序列231位点突变为丙氨酸 的基因序列。小鼠TBC1D1氨基酸序列如SEQID:NO7所示，突变后得到的TBC1D1氨基酸 序列如SEQID:NO6所示。
[0014] 本发明还提供了一种含有编