与水稻atp运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与水稻ATP运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国最主要的粮食作物，我国60%以上的人口以稻米为主食。目前采用 高光效育种已经成为提高作物产量的重要手段，高等植物进行光合作用的唯一场所是叶绿 体，而水稻叶色突变体是研宄植物叶绿体发育、光形态建成和光合作用等过程的理想材料。 叶绿体除了进行光合作用以外，它还与细胞核以及线粒体存在着复杂的信号交流，以便协 同作用维持植物的正常生长发育。ATP是细胞中最主要的能量来源，是所有遗传物质的组成 分子，还是许多酶的辅助因子，可作为信号传递中的次级信使，因此在植物新陈代谢上起着 至关重要的作用。由于ATP本身电荷和大小的限制，它不能自由穿梭于生物膜，满足其他异 养器官的生长要求，就需要一种特定的蛋白对ATP进行跨膜运输。
[0003] BT蛋白是线粒体转运家族（MCF)的重要成员，在高等植物中具有较保守的序列和 结构。这类蛋白一般定位于细胞器的膜上，负责一些大分子物质的跨膜运输，对植物的生长 发育起到重要的供能作用。目前已报到的BT蛋白数量很少，研宄最为清楚的就是玉米的 ZmBTl蛋白，该蛋白镶嵌在造粉体膜上向内转运ADP葡萄糖，从而促进籽粒中淀粉的合成， 对于谷类作物籽粒淀粉的形成起到关键作用。另外还有一类BT蛋白，如拟南芥的AtBTl，具 有叶绿体和线粒体双重定位信号，负责能量物质ATP/ADP/AMP的转运，对于拟南芥的生长 发育发挥重要功能。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与水稻ATP运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基 因和应用。
[0005] 本发明提供的蛋白质，命名为OsBT3蛋白，来自水稻品种Nipponbare，是如下（a) 或（b):
[0006] (a)由SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] (b)将SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与叶绿体ATP运输和叶绿体发育相关的由序列1衍生的蛋白质；
[0008] 上述（b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNO. 2所示的DNA序列中缺失一个或几个 氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或 3'端连上标签的编码序列得到。
[0009] 编码所述0sBT3蛋白的基因（0sBT3)也属于本发明的保护范围。
[0010] 所述0sBT3基因是如下（1)或⑵或（3)或⑷的DNA分子：
[0011] (1)编码区如SEQIDNO. 2所示的DNA分子；
[0012] (2)基因组如SEQIDNO. 3所示的DNA分子；
[0013] (3)在严格条件下与（1)或⑵限定的DNA序列杂交且编码与植物叶绿体ATP运 输和叶绿体发育相关的蛋白的DNA分子；
[0014] (4)与（1)或⑵或（3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码与植物叶 绿体ATP运输和发育相关蛋白的DNA分子。
[0015] 所述严格条件为在0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下杂 交并洗膜。
[0016] 含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
[0017] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
[0018] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆 贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0019] 使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因 构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可 以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证 整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也 可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0020] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0021] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，为抑制目的植物中编码所述0sBT3蛋 白的基因的表达，得到ATP运输能力降低的转基因植物。本发明还保护一种培育转基因植 物的方法，为抑制目的植物中编码所述0sBT3蛋白的基因的表达，得到叶绿体发育受限的 转基因植物。
[0022] 所述"抑制目的植物中编码所述0sBT3蛋白的基因的表达"是通过在所述目的植 物中导入干扰载体实现的；所述干扰载体为将特异DNA片段甲和特异DNA片段乙分别插入 表达载体的不同多克隆位点得到的重组质粒；所述DNA片段甲如序列表的序列2自5'末端 第853至1260位核苷酸所示；所述DNA片段甲和所述DNA片段乙反向互补。
[0023] 所述表达载体具体可为pCUbi1390 -AFAD2载体。
[0024] 所述干扰载体具体可为如下重组质粒：骨架载体为pCUbi1390 -AFAD2载体，在其 KpnI酶切位点正向插入了SEQIDNO. 2中自5'末端第853至1260位核苷酸所示的双链 DNA片段，在其BamHI酶切位点插入了与SEQIDNO. 2自5'末端第853至1260位核苷酸 所示的双链DNA片段反向互补的双链DNA片段。
[0025] 含有所述OsBT3基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明 的保护范围。
[0026] 所述OsBT3蛋白在调节植物质体ATP运输和叶绿体发育中的应用也属于本发明的 保护范围。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为水稻，如水稻Nipponbare。
[0027] 有益效果：
[0028] 本发明的实验证明，缺失0sBT3基因的植株叶片呈现白条纹，叶绿素含量降低，叶 绿体发育出现严重缺陷，光合能力下降，植物逆行信号受阻，参与叶绿素合成和光合作用的 基因表达下调；另外ATP/ADP转运能力下降，植物整体新陈代谢速率下降。即0sBT3蛋白参 与叶绿体ATP的转运，另外对叶绿体分化发育也具有重要作用。本发明对于进一步阐明植 物叶绿体发育的分子机理并通过基因工程的技术和手段培育高光合效率的作物新品种具 有重要的理论意义和现实意义。
【附图说明】
[0029] 图1为野生型9311和突变体bt3的苗期叶片表型。
[0030] 图2为野生型9311和突变体bt3的苗期叶绿体超微结构观察。
[0031] 图3为野生型9311和突变体bt3叶绿体ATP转运活性分析。
[0032] 图4为转基因干扰载体pCUbil390 -AFAD2结构图。
[0033] 图5为转基因植株表型观察及表达水平检测结果。
【具体实施方式】
[0034] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0035] 实施例1、水稻叶绿体ATP运输及发育相关蛋白及其编码基因的发现
[0036] 一、水稻叶色突变体bt3表型分析
[0037] 1、在9311突变体库中筛选出叶色表型的株系bt3。
[0038] 与野生型相比较，bt3的主要特征是叶片苗期呈现白条纹表型（见图1A)，叶绿素 含量显著下降（见图1B)。透射电镜观察显示叶绿体发育异常，类囊体片层结构排列松散， 基粒堆叠减少（见图2)。
[0039]叶绿素测定方法参照（LichtenthalerHK.Chlorophyllsand carotenoids:Pigmentsofphotosyntheticbiomembranes.Nature. 1987 ； 148:350-382.)〇
[0040] 叶绿体超微结构的观察参考（WuZ，ZhangX，HeB，DiaoL，ShengS，WangJ，Guo X,SuN,WangL,JiangL,WangC,ZhaiH,WanJ.Achlorophyll-deficientricemutant withimpairedchlorophyllideesterificationinchlorophy