一种肠膜明串珠菌冻干制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌冻干制剂及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 明串珠菌（Leuconostoc)是一类乳品生产中重要的商业化乳酸菌株，属于革兰氏 阳性菌。研宄表明，明串珠菌具有调节肠道紊乱、代谢果糖生成甘露醇、合成K族维生素、水 解a-半乳糖苷、产细菌素等益生功能，同时有助于形成干酪孔眼、产生风味物质。此外， 明串珠菌可在糖基转移酶的作用下，利用蔗糖为底物合成右旋葡聚糖（dextran，多糖的一 种），具有增粘、稳定、乳化水体系以及持水性等特性，可见，明串珠菌的功能受到食品行业 广泛的重视与认同，而明串珠菌冻干制剂的制备将进一步推动其在食品工业的应用。
[0003] 真空冷冻干燥技术是将湿物料或溶液在较低的温度（一般为一 10°C~一 50°C ) 下冻结成固态，然后在真空条件下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱 水的干燥技术，乳酸菌可通过这种干燥技术保持较高的生理特性，并可直接投入食品生产 中。为了增强菌株在冻干过程中的存活性能，除了对冻干工艺的优化外，冻干保护剂的选择 也是影响乳酸菌干燥过程中细胞稳定性的重要外部因素。目前，常用的冻干保护剂有海藻 糖、乳糖、蔗糖、D-山梨醇、脱脂奶粉、糊精等，而冻干工艺通常为菌种的培养、离心收集、添 加保护剂制备菌体的悬浮液、预冻、真空冷冻干燥。可见，现有乳酸菌冻干制剂的制备所涉 及的配方复杂（一个配方往往会涉及多种冻干保护剂），工艺繁琐（通常需要乳酸菌预先培 养收集后重悬于无菌的冻干保护液中，再经预冻、冷冻干燥获得冻干的乳酸菌制剂），而复 杂的配方和繁复的操作大大增加了活菌制剂在制备过程中被污染的风险，进而对消费者形 成了潜在的威胁。此外，随着生活质量的不断提高，与我们每个人日常生活息息相关的乳酸 菌制剂所采用的冻干保护剂（糊精等）的食品安全问题越来越受到消费者的重视，因此，寻 找来源天然、操作简便、存活率高、保存稳定性佳的新型乳酸菌冻干制剂的制备方法将是未 来乳酸菌冻干制剂制备的重要研宄方向之一。
【发明内容】
[0004] 因此，本发明为了解决目前缺乏来源天然、操作简便、益生菌存活率高、保存稳定 性佳的肠膜明串珠菌冻干制剂的问题，提供了一种肠膜明串珠菌冻干制剂及其制备方法和 应用。
[0005] 本发明人发现，由于现有肠膜明串珠菌冻干制剂的制备所涉及的配方相当复杂， 正如背景部分所述，包括海藻糖、乳糖、蔗糖、D-山梨醇、脱脂奶粉、糊精等等，由于冻干制剂 的配方复杂，对植肠膜明串珠菌冻干制剂原料的安全性提出了更高的要求，同时大大增加 了在制备过程中产生污染的风险，进而对消费者构成了潜在的威胁，这种现状与当前消费 者日益增强的食品安全意识构成了极大的矛盾和冲突，为了解决这一矛盾，发明人对乳酸 菌特别是肠膜明串珠菌的培养方式，包括培养基的选择，发酵培养的温度、时间等一系列技 术参数进行了认真的分析和筛选，最终得到了本发明所述的技术方案以及所得肠膜明串珠 菌冻干制剂的原料来源天然，其制备方法工艺简便，所得肠膜明串珠菌冻干制剂中菌株存 活率高、保存稳定性佳的技术效果。
[0006] 因此，为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种肠膜明串珠菌冻 干制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)将肠膜明串珠菌（L.mesenteroides)接种于番前汁鹿糖培养基中，所述番前 汁蔗糖培养基中蔗糖的质量百分比浓度为5-20%，其余为番茄汁，20-35°C，100-300rpm振 荡培养8-48小时，获得发酵液；
[0008] (2)将步骤⑴所得发酵液的pH值调节至6. 5-7. 5,冷冻干燥即得。
[0009] 其中步骤（1)是将肠膜明串珠菌（L. mesenteroides)接种于番前汁鹿糖培养基 中，所述番茄汁蔗糖培养基中蔗糖的质量百分比浓度为5-20%，其余为番茄汁，20-35°C， 100-300rpm振荡培养8-48小时，获得发酵液。其中所述肠膜明串珠菌较佳地为：肠膜明 串珠菌BD1710,肠膜明串珠菌LM57或肠膜明串珠菌LM79。上述几种肠膜明串珠菌的菌株 为现有技术，其制备方法为本领域常规制备方法，或者通过购买获得。其中所述番茄汁蔗 糖培养基为本领域常规的番茄汁蔗糖培养基，该番茄汁蔗糖培养基较佳地由包括以下步骤 的方法制备：清洗成熟番茄，去皮榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清，加入蔗糖加热 溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。其中所述过滤的方法较佳地为利用100目纱布 过滤取汁，所述煮沸的时间较佳地为1-10分钟，所述离心的速度较佳地为4, 000-12, 000g， 离心的时间较佳地为8-12分钟，蔗糖的加入量较佳地为5-20%，所述灭菌的温度较佳地为 110-135°C，灭菌时间较佳地为10-30分钟，pH值较佳地为6. 5-7. 5。其中所述培养的温度 较佳地为25-30°C，更佳地为28°C，震荡的速度较佳地为150-200rpm，更佳地为180rpm，培 养的时间较佳地为26-45小时，更佳地为40小时。
[0010] 其中步骤（2)是将步骤（1)所得发酵液的pH值调节至6. 5-7. 5,冷冻干燥即得。 其中所述调节pH值的方法为本领域常规方法，较佳地为利用食品级碱调节pH值，所述食品 级碱为本领域常规，较佳地是：Na 2C03、NaHC0#P NaOH中的一种或多种。
[0011] 本发明所述的冻干为本领域常规的冻干方法，所述冻干方法较佳地为真空冷冻干 燥，其中所述真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度< _60°C，冷阱极限温度-70°C，板 层装料厚度〇? 5~2. Ctam，真空度10~30Pa〇
[0012] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种肠膜明串珠菌冻干制 剂，所述肠膜明串珠菌冻干制剂由包括以下步骤的方法制备而得：
[0013] (1)将肠膜明串珠菌（L. mesenteroides)接种于番前汁鹿糖培养基中，2〇-35°C， 100-300rpm振荡培养8-48小时，获得发酵液；
[0014] (2)将步骤（1)所得发酵液的pH值调节至6. 5-7. 5,冷冻干燥即得。
[0015] 其中各步骤所述技术特征的优选范围与上文所述肠膜明串珠菌冻干制剂的制备 方法中相应的内容完全一致。
[0016] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：一种如上所述肠膜明串珠 菌冻干制剂在制备食品或膳食添加剂中的应用。
[0017] 本发明所述的应用为本领域常规的应用，所述应用较佳地包括利用本发明所述肠 膜明串珠菌冻干制剂制备发酵食品，乳制品中的用途，或者将所得肠膜明串珠菌冻干制剂 作为膳食添加剂或营养添加剂等用途。
[0018] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0019] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0020] 本发明的积极进步效果在于：
[0021] 1、本发明所述肠膜明串珠菌冻干制剂的制备方法采用的原料来源天然，与现有的 冻干制剂技术所用的复合配方相比，制备获得的冻干制剂具有更高的食品安全性；
[0022] 2、本发明所述肠膜明串珠菌冻干制剂的制备方法工艺简便，一方面省略了传统冻 干制剂制备工艺中菌体收集的步骤，最大程度上减少了菌体收集时造成的机械损伤；另一 方面，省去了后续冻干保护剂的复配与菌体重悬的步骤，大大降低了冻干制剂制备过程中 污染的可能性。
[0023]3、采用本发明的制备方法获得的肠膜明串珠菌冻干制剂中菌株存活率高、保存稳 定性佳，其可作为一种新型的制备方法应用于肠膜明串珠菌冻干制剂工业化生产及相关领 域中，应用前景十分广阔。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为15-25°C。
[0025] 实施例1肠膜明串珠菌冻干制剂的制备与存活率、活菌数的测定
[0026] 1、材料与方法
[0027] 番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取 汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清，加入15% (w/v)鹿糖加热溶解后冷却至室温，以食 用级碱调节pH至7. 0,121°C灭菌20min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
[0028] 种子（发酵菌种）的制备：
[0029] 将L. mesenteroides BD1710 (所述肠膜明串珠菌的保藏编号为CGMCCNo. 6432,该 菌株的来源请参见公开号为CN 103013891A的中国专利）的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶 解，用接种环取一环划线于含2% (w/v)鹿糖的M17琼脂培养基（Merck Co.德国）上，28°C 好氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入20mL含2% (w/v)蔗糖的M17液体培养基 (Merck Co.德国），28°C 180rpm摇床培养24h取出，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上 清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
[0030] 2、肠膜明串珠菌冻干制剂的制备
[0031] (1)将所得L. mesenteroidesBD1710的种子按接种量2 % (v/v)无菌接种于 PH7.0、蔗糖浓度为15% (w/v)的番茄汁蔗糖培养基中，28°C、180rpm振荡培养24小时，获 得发酵液。
[0032] (2)将发酵液以无菌的食用级碱液调节pH至7.0,冷冻干燥后即得BD1710的冻干 制剂S1。
[0033] 3、肠膜明串珠菌冻干制剂存活率、