微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶及其分离纯化方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质分离纯化与酶学特性研宄及应用技术领域，特别涉及一种微杆 菌来源的桃胶多糖裂解酶及其分离纯化方法与应用。
【背景技术】
[0002] 桃胶系桃、李、杏、樱桃等蔷薇科植物树干受机械伤（如虫咬、切伤等）或致病后分 泌出来的胶质半透明物质，为多糖类物质，由半乳糖和阿拉伯糖构成其多糖骨架的主要成 分。桃胶已被用于食品、医药等领域。
[0003] 近年来，低聚糖因具有抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等生物学活性而备受关注，成 为糖生物学新的研宄热点。利用酶解法加工原桃胶，不仅可以使原桃胶分解、生产具有广泛 工业用途的可溶性商品桃胶，更可以使桃胶多糖的骨架裂解，获得功能性低聚糖。利用酶解 法加工原桃胶，先决条件在于得到能裂解原桃胶的酶以及该酶在以桃胶为底物时的最佳酶 解条件。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种微杆菌来源的桃胶 多糖裂解酶的分离纯化方法。
[0005] 本发明的另一目的在于提供通过上述分离纯化方法得到的微杆菌来源的桃胶多 糖裂解酶。
[0006] 本发明的再一目的在于提供所述微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶的分离 纯化方法，包括如下步骤：
[0008] (1)菌种的驯化：
[0009] ①第一次驯化：将微杆菌A5种子液接种到含有质量百分比2%桃胶的LB培养基 中，于摇床中培养至桃胶溶解，得到第一次驯化液；
[0010] ②第二次驯化：将第一次驯化液接种到含有质量百分比4%桃胶的LB培养基中， 于摇床中培养至桃胶溶解，得到第二次驯化液；
[0011] ③第三次驯化：将第二次驯化液接种到含有质量百分比6%桃胶的LB培养基中， 于摇床中培养至桃胶溶解，得到第三次驯化液；
[0012] ④第四次驯化：将第三次驯化液接种到含有质量百分比8%桃胶的LB培养基中， 于摇床中培养至桃胶溶解，得到第四次驯化液；
[0013] ⑤第五次驯化：将第四次驯化液接种到含有质量百分比10%桃胶的LB培养基中， 于摇床中培养至桃胶溶解，得到驯化好的种子液；
[0014] (2)发酵培养：将驯化好的种子液接种到发酵培养基中，于摇床中培养至桃胶完 全溶解；发酵培养基为含有质量百分比6%桃胶的LB培养基，初始pH值为6 ;
[0015] (3)分离纯化：
[0016] ①将发酵液离心，去除菌体，取上清；
[0017] ②在上清中加入硫酸铵至饱和，于4°C静置过夜；离心收集沉淀，随后用磷酸缓冲 液将沉淀复溶；接着用磷酸缓冲液进行透析，期间更换磷酸缓冲液数次直至透析完全；透 析结束后，透析液离心除去不溶杂蛋白，收集上清液待纯化；
[0018] ③将步骤②得到的上清液上样到苯基琼脂糖凝胶6FF(PhenylSepharose6Fast Flow)柱中，收集第二个穿柱峰；
[0019] ④对第二个穿柱峰上样到ToyopearlDEAE-650S柱中，接着用磷酸缓冲液进行平 衡，而后再用〇. 6MNaCl溶液进行洗脱，收集第一个洗脱峰；
[0020] ⑤将第一个洗脱峰透析后冻干，得到桃胶多糖裂解酶。
[0021] 步骤（1)①中所述的微杆菌A5已在专利号为"200910193340.X"、名称为"桃胶分 解酶生产菌株及其在制备桃胶多糖中的应用"中公开；
[0022] 步骤（1)①中所述的微杆菌A5种子液优选通过如下步骤得到：首先将微杆菌A5 于LB平板上划线；再挑菌落接种到LB液体培养基中，摇床中进行培养，得到微杆菌A5种子 液；
[0023] 本发明中所述的摇床的条件优选设置为28~30°C、180~200rpm;更优选为 30°C、180rpm;
[0024] 步骤⑴中所述的接种的量优选为体积百分比7. 5% ;
[0025] 步骤⑵中所述的接种的量优选为体积百分比10%;
[0026]步骤（3)中所述的离心的条件优选为4°C、lOOOOrpm离心20min;
[0027] 步骤（3)②中所述的磷酸缓冲液优选为20mmol/L、pH6. 0的磷酸缓冲液；
[0028] 步骤（3)②中所述的透析完全为往磷酸缓冲液中滴入硝酸银溶液时无沉淀；
[0029] 步骤（3)③中所述的第二个穿柱峰的获得条件优选为：使用规格为01OX 200mm的苯基琼脂糖凝胶6FF层析柱，上样流速为1. 0ml/min，紫外检测器的检测条件为 280nm；
[0030] 步骤（3)④中所述的上样的速度优选为1. 0ml/min;
[0031] 步骤（3)④中所述的磷酸缓冲液的平衡的速度优选为1. 0ml/min;所述的磷酸缓 冲液优选为pH6、20mM的磷酸缓冲液；
[0032] 步骤（3)④中所述的洗脱的速度优选为1. 0ml/min;
[0033] 步骤（3)④中所述的洗脱峰为通过280nm的紫外检测器进行监测。
[0034] 一种微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶，通过上述分离纯化方法得到。
[0035] 所述的微杆菌来源的桃胶多糖裂解酶用于裂解桃胶，使用条件优选为：30~ 40°C、pH值为5~7的磷酸缓冲液；更优选为30°C、pH值为6的磷酸缓冲液；最优选为30°C、 pH值为6的磷酸缓冲液，配以ImM的K+、Ca2+和Mn2+中的一种或至少两种离子，或配以10mM 的Na+和Mg2+中的一种或两种离子。
[0036] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0037](1)本发明提供的方法在发酵之前先经过2%、4%、6%、8%、10%桃胶质量百分 比的前期驯化，有利于诱导菌株产生桃胶多糖裂解酶；然后以质量百分比6%原桃胶的发 酵液进行发酵产酶；接着通过PhenylSepharoseFastFlow将发酵上清液中的疏水性蛋 白进行吸附起到除去杂蛋白的目的，具有分解桃胶多糖的裂解酶以穿柱液的形式保留在穿 柱液中，结合ToyopearlDEAE-650S的使用，将具有分解桃胶多糖活性的裂解酶吸附在柱子 上，利用浓度为〇. 6M的NaCl溶液进行洗脱，得到具有活性的裂解酶，而且利用本方法制取 分解桃胶多糖的裂解酶国内外文献还没有报道。
[0038] (2)本发明提供的方法不仅操作方便，而且通过该方法得到的桃胶多糖裂解酶能 保持酶活。
[0039] (3)本发明提供的桃胶多糖裂解酶的使用条件是该桃胶多糖裂解酶的最佳反应条 件，能很好地分解原桃胶。
【附图说明】
[0040] 图1是HPLC对酶解产物进行分析时标准糖类的图谱图。
[0041] 图2是酶解反应时对照组样品的HPLC分析结果图。
[0042] 图3是酶解反应时反应组样品的HPLC分析结果图。
[0043] 图4是温度对桃胶多糖裂解酶活性的影响的结果图。
[0044] 图5是pH值对桃胶多糖裂解酶活性的影响的结果图。
[0045] 图6是金属离子及抑制剂对酶催化活性的影响的结果图。
[0046] 图7是桃胶多糖裂解酶作用于底物桃胶的米氏方程图。
[0047] 图8是桃胶多糖裂解酶作用于底物桃胶的双倒数图。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0049] 实施例
[0050] 一、制备桃胶裂解酶
[0051] (1)菌体的前期驯化：用接种针挑取试管斜面保藏的菌株（微杆菌A5,已在专利 号为"200910193340.X"、名称为"桃胶分解酶生产菌株及其在制备桃胶多糖中的应用"中 公开）于LB平板培养基上划线，随后将平板放置于30°C的恒温培养箱中培养。待平板上 长出单克隆，挑取单克隆于LB液体培养基中，于180rpm、30°C的摇床中培养，作为第一次驯 化的种子液。第一次驯化，培养基为含有质量百分比2%桃胶的LB培养基（500mL三角瓶 装液量为150mL)，接入种子液20mL，于180rpm、30°C的摇床中培养至桃胶溶解；第二次驯 化，培养基为含有质量百分比4%桃胶的1^培养基（50〇1^三角瓶装液量为15〇11^)，接入第 一次驯化液20mL，于180rpm、30°C的摇床中培养至桃胶溶解；第三次驯化，培养基为含有质 量百分比6%桃胶的1^培养基（50〇1^三角瓶装液量为15〇1^)，接入第二次驯化液2〇1^， 于180rpm、30°C