一种种皮与纤维组织特异性表达启动子sfs及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种种皮与纤维组织特异性表达启动子SFS及其应用，具体为一种能 够在植物种子表皮和棉花纤维特异表达的启动子ProSFS (简称为SFS启动子）以及该启动 子在植物遗传改良上的应用。
【背景技术】
[0002] 植物生长发育是不同基因在时间、空间上有序表达和协同作用的过程。基因在整 个生长过程中的开关、表达模式以及表达丰度等均受到精确调控。植物基因的表达调控可 以分为转录前、转录、转录后、翻译、翻译后等5个不同水平，其中转录水平上的调控是最主 要和最为关键的环节。基因在转录水平上的调控主要是通过调控转录调节因子与启动子的 结合与否、强弱变化等来实现。因此，分离克隆有关特异的启动子可以有效调苄基因的转录 水平，包括基因在不同组织以及不同环境条件下的表达。此外，获得组织特异性启动子对于 转基因作物的研宄以及商业化开发都具有重大意义。
[0003]组织器官特异型启动子按照植物组织器官可以分为根、维管束、花器官、种子特异 以及其它组织特异表达启动子等。组织器官特异型启动子可以定向表达外源蛋白，在发育 生物学研宄、以及植物基因工程方面逐步得到应用。果实和种子是植物的生殖器官、营养物 质主要的储藏场所。利用果实或种子等器官特异启动子来调控相应的目的基因表达，不但 可以提高基因在这些部位的表达量，而且可以降低生物能耗，有利于表达产物的分离以及 提高作物的产量和品质。
[0004] 来源于小麦的TaPR61基因启动子在禾本科作物中可以维持其种子特异表达的模 式（Kovafchuk et al，2012)。瓜尔豆甘露糖聚合酶基因的启动子能够在紫花苜蓿的胚乳 组织中特异表达（Naoumkina and Dixon, 2011)。近年来，分离与种子特异表达有关的启动 子还包括：来源于西瓜的果实特异表达基因AGPL1的启动子（Yin et aL，2009)、番茄的E8 基因启动子等。研宄表明：2个胚乳特异表达顺式作用元件一GCN4和AACA对于维持基因 的胚乳特异表达模式起着重要的作用（Qu and Takaiwa, 2004 ;Wu et aL, 1998 ;Takaiwa et aL，1996)。此外，糊粉层特异表达的基因ALJ启动子、胚乳特异表达启动子Gtl3a在生物反 应器上展现了很好的应用前景（Kuwano et al，2011 ;He et al，2011)。
[0005]尽管科学家已经在不同的植物种克隆了上述与种子特异表达有关的启动子，但是 到目前为止还没有有关具有种皮特异和棉花纤维组织特异的启动子报道。
【发明内容】
[0006]本发明针对上述技术缺陷，目的在于提供一种种皮与纤维组织特异性表达启动 子-SFS及其应用，即提供一种新的能够在植物种皮以及棉花纤维组织中特异表达的启动 子SFS〇
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008]第一方面，本发明提供一种核苷酸SFS，序列如SEQ ID NO. 1所示；该序列可以通 过人工合成的方法进行合成，也可以通过PCR和酶切的方法从棉花的基因组中进行克隆。
[0009] 第二方面，本发明提供一组用于扩增所述核苷酸SFS的外侧引物对，所述外侧引 物对的序列如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 第三方面，本发明提供一组用于扩增所述核苷酸SFS的内侧引物对，所述内侧引 物对的序列如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示。
[0011] 第四方面，本发明提供一种重组载体，包含所述核苷酸SFS，如实施例1中的连接 核苷酸SFS的pMD18-T载体等。
[0012] 第五方面，本发明提供一种转化体，包含所述核苷酸SFS，所述转化体采用的宿主 为大肠杆菌或农杆菌。
[0013] 第六方面，本发明提供一种所述核苷酸SFS作为启动子的用途。
[0014]优选地，所述用途具体为核苷酸SFS作为启动子在驱动植物中目的基因在特定组 织中表达的应用；所述植物包括棉花、拟南芥；所述组织包括表皮、纤维等。
[0015] 优选地，所述核苷酸SFS作为启动子在驱动植物中目的基因在特定组织中表达的 应用具体为用所述转化体的悬浮液浸泡植物组织。
[0016] 优选地，所述用途具体为核苷酸SFS作为启动子在植物育种中的应用。
[0017] 第七方面，本发明提供一种所述核苷酸SFS的制备方法，包括人工合成法或生物 克隆法；
[0018] 优选地，所述核苷酸SFS的人工合成的方法具体为：
[0019] 步骤一、根据核苷酸SFS的正链和副链序列，分别合成出长度150~200bp、具有粘 性末端的单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段；
[0020] 步骤二、将所述单链寡核苷酸正链片段和单链寡核苷酸副链片段分别退火，形成 带有粘性末端的双链寡核苷酸片段；
[0021] 步骤三、混合所述双链寡核苷酸片段，经T4DNA连接酶催化组装成一个完整的核 苷酸SFS。
[0022] 优选地，所述生物克隆法具体为：
[0023] 步骤1、提取棉花DNA ;
[0024] 步骤2、以所述DNA为模板，依次用所述外侧引物、内侧引物进行扩增；
[0025] 步骤3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，即得核苷酸SFS。
[0026] 优选地，所述棉花为陆地棉。
[0027] 本发明首次采用分子克隆方法，从陆地棉（Gossypium hirsutum)基因组中分离获 得了新的SFS启动子，并且通过转基因实验证实了它具有种皮及纤维组织特异性，利用该 启动子可以特异驱动基因在上述组织中高水平地转录表达，从而达到了本发明目的。
[0028] 本发明克隆分离组织特异表达启动子SFS，并利用该启动子在拟南芥中特异表达 报告基因以提高基因在特定组织的表达水平。
[0029] 本发明的SFS启动子具有如下特性:A)在棉花和拟南芥组织的表达情况十分明 确，该启动子在棉花等植物上没有报道；B)结构新，在核酸水平上与已见报道的其它启动 子无任何同源性，同源性位点不含有现有专利保护序列和突变位点。
[0030] SFS启动子为提高基因在植物种皮、以及棉花纤维的衣分含量提供了新的途径，因 而具有巨大的应用前景。
【附图说明】
[0031] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0032]图1是SFS启动子遗传转化载体的构建示意图；
[0033] 其中，LB、RB分别为T-DNA的左右边界序列，SFS为本发明所特异表达启动子，NOS 为终止子；
[0034]图2是转SFS启动子转化拟南芥的不同组织的⑶S染色分析图；
[0035] 其中，A :根；B