过表达Galectin-1基因编码蛋白永生化细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种过表达Galectin-1基因永生化细胞系的制备方法，特别是涉及一种过表达Galectin-1基因编码蛋白过表达BHK细胞系的制备方法，属于生物技术和细胞遗传学领域，本发明具有深远的研宄性和广泛的应用性，包括研宄宿主细胞免疫反应具有稳定性以及可表达所需蛋白的哺乳动物细胞的永生化，以及该过表达细胞系对狂犬病病毒增殖的滴度的影响。
【背景技术】
[0002]半乳糖凝集素(Galectin-1)也是一种重要的信号转导类蛋白，并且在各个感染组均呈较一致的下调表达。Galectin-1是自然界广泛存在的一类选择性识别糖结构并与其非共价结合的蛋白质，是动物凝集素家族中的一员，存在于从线虫、海绵到哺乳动物等各种动物体内。Galectin-1大部分功能是在细胞表面和细胞外执行，与受体的结合可以启动多种信号转导途径，参与细胞黏附、生长调节和免疫反应等多种生物学功能。Galectin-1与CD7结合激活AP-1，并下调Bcl-2的表达，这很可能是Calectin-1诱导凋亡的分子机制。1n等发现Galectin-1激发线粒体途径的凋亡程序，它通过激起酸性神经磷脂酶调节神经胺酸的释放，降低Bcl-2蛋白的产量，激活caspase 9和caspase 3诱导的细胞凋亡。
[0003]重组Galectin-1能促进神经细胞轴突的再生，这一过程可被相应抗体强烈抑制。Galectin-1在神经细胞中可调节细胞增殖，其mRNA可在各种神经元的细胞体中观察到，如三叉神经细胞、外展神经细胞等，其在胶质瘤中的表达水平也可反映星型细胞瘤到胶质母细胞瘤的恶性程度，这可能与本实验选用的小鼠母神经瘤细胞N2a有一定相关性。
[0004]Galectin-1在病毒感染发生时可以发挥抑制作用，副粘病毒家族冠膜蛋白调节的细胞融合作用受到Galectin-1的抑制，表明其抗病毒作用。Galectin-1可作为HIV-1稳定黏附到细胞表面的可溶性因子，诱导HIV-1感染的表面糖基化增加的T细胞凋亡。Rubinstein等通过反义核酸技术革El向性抑制肿瘤细胞中Galectin-1的表达后发现，封闭Galectin-1基因会增强T细胞的调节作用。我们通过比较蛋白质组学技术也发现，Galectin-1在各个RV感染组与正常组比较中均呈下调表达，而在不同毒株感染组间表达水平基本一致，说明RV感染N2a细胞时Galectin-1的表达受到了抑制，进而调节了细胞的增殖，抵抗细胞凋亡的发生，有利于RV的持续性感染。另外，RV感染易感细胞系、小鼠脑组织以及犬外周血单核细胞的差异蛋白质组学比较中也发现Galectin-1的表达发生了显著变化，这说明RV感染时Galectin-1可能发挥着关键的调节作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种过表达Galectin-1基因永生化细胞系的制备方法，容易培养，增殖速度快速，可无限扩大，性质稳定，易保存，方法技术成熟，重复性强，一般研宄人员即可完成。具有遗传稳定性。
[0006]本发明的技术方案是一种过表达Galectin-1基因永生化细胞系的制备方法，首先设计针对Galectin-1基因的特异性引物，使用RT-PCR扩增鼠源Galectin-1整个编码基因，然后连接PMD-18T载体，经酶切和PCR鉴定正确后测序，测序正确后命名为pMD-Ga ；然后，酶切PMD-Ga获得Galectin-1基因片段，相应的克隆至真核表达载体pIRESneo的多克隆酶切位点中，再经经酶切和PCR鉴定正确获得pIRESneo-Ga质粒；大量制备高纯度的PlRESneo-Ga质粒使用FuGENE转染试剂转染BHK细胞系，经G418抗性压力筛选，获得稳定的细胞克隆，扩大培养后，再经Western Blot验证获得过表达Galectin-1基因的稳定的细胞系；具体步骤如下:
UGalectin-1 基因的 RT-PCR 扩增
根据GenBank中Galectin-1核苷酸序列设计并合成了下列引物上游 Galectin-1-F: 5’ -gatatctcaa tcatggcctg tggtc 下游 Galectin-1-R: 5’ -ggatcctgcc tttattgagg gctaca 用上述引物进行RT-PCR扩增得到450bp的片段；见图1。
[0007]2、Galectin-1基因与pMD_18T载体的连接及测序
根据PMD-18T载体的说明书进行体外转录模板序列与骨架载体的连接。然后用酶切方法证明了体外转录载体的正确构建见图2 ;测序结果见序列I。
[0008]3、Galectin-1 基因与 pIRESneo 载体的连接
酶切连接在PMD-18T载体测序正确的Galectin-1基因片段，体外连接真核表达载体pIRESneo骨架，转化JM109感受态细胞获取重组子；然后用酶切方法证明了 pIRESneo-Ga质粒的正确构建，见图3。
[0009]4、PIRESneo-Ga 质粒的制备
用Luria-Bertani Medium培养基培养l_3ml浓度为1-1.5 OD6tltl值的含目的基因重组质粒菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒。
[0010]5、pIRESneo-Ga质粒的稳定转染
用含5-10小牛血清的Minimum Essential Medium作为基础培养基，重组pIRESneo-Ga质粒经FuGENE转染试剂(Roche公司)介导传染70-80%融合的生长旺盛的单层BHK细胞。
[0011]6、G418压力筛选单克隆化细胞
在含500 μ g/ml浓度G418的Minimum Essential Medium的培养基中，通过极限稀释法获得单克隆化细胞，见图4。
[0012]7、永生化细胞系的鉴定
单克隆化细胞经RT-PCR、Western Blot检测后，获得含目的基因的永生化细胞。
[0013]本发明运用重组DNA技术、细胞重组技术，采用反转录PCR方法获得了鼠源Galectin-1基因，以之为模板构建了表达编码蛋白的整合表达载体，经FuGENE介导转染70-80%融合的生长旺盛的单层BHK细胞，在G418抗性压力和96孔板极限稀释法克隆抗性单细胞，运用RT-PCR和Western Blot技术证实Galectin-1基因已成功转染至BHK细胞，并整合到细胞的基因组中且过表达目的蛋白。
[0014]本发明的积极效果在于容易培养，增殖速度快速，可无限扩大，性质稳定，易保存，方法技术成熟，重复性强，一般研宄人员即可完成。
【附图说明】
[0015]图1 是 Galectin-1 基因 RT-PCR 扩增图，1.Galectin-Ι 基因(450bp)M.DL2000 ；
图2是Galectin-1基因连接pMD-Ga酶切鉴定图，1.质粒对照2.EcoR I酶切3.EcoRV 酶切 4.EcoR I+EcoR V 酶切 M.6280 Marker5.DL2000 ；
图 3 是 Galectin-1 基因连接 pIRESneo-Ga 酶切鉴定图，1.DL20002.EcoR V+BamH I3.Sma I
4.EcoR I 5.质粒对照 6.6280 DNA Marker ；
图4是G418压力筛选单克隆细胞株图；
图5是Western Blot验证Galectin-Ι基因过表达图；
图6是pIRESneo-Ga载体构建过程图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和实施例对本发明做进一步描述；这些实施例展示的是在G418压力下过表达Galectin-Ι基因编码蛋白永生化细胞系的建立，具有遗传稳定性。
[0017](一)pMD-Ga载体的构建和测序
1、寡核苷酸引物的设计与合成
根据GenBank中Galectin-Ι核苷酸序列设计并合成了下列引物上游 Galectin-1-F: 5’ -GATATCTCAATCATGGCCTGTGGTC 下游 Galectin-1-R: 5’ -GGATCCTGCCTTTATTGAGGGCTACA
2、BHK细胞总RNA的提取
50ml细胞培养瓶的BHK细胞直接加ImL Trizol,室温放置5min，使其充分裂解，12000r/min离心5min，取上清，按200 μ L氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡混勾室温放置15min，4°C 12 000r/min离心15min，吸上清，至另一离心管中，按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5?10min，4°C 12 000r/min离心lOmin，弃上清，RNA沉于管底。按ImL 75%乙醇/mL Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，4°C 12 OOOr/min离心lOmin，弃上清，室温干燥后，加20 yL RNase-free的水溶解，一 80°C保存备用。
[0018]3、Galectin-Ι基因片段全长cDNA合成
总 RNA 5yL，70°C 加热 lOmin，冰浴 5min，加 200U 反转录酶 M-MLV，25pmol/μ L 引物F、25pmol/yL 引物 R 及 10mmol/L dNTPs 各 I μ L，42°C反应 60min，即得到 cDNA。70°C水浴 lOmin，灭活反转录酶。取反转录产物 10 μ L，1XPCR buffer 4yL、25mmol/L MgCL24 μ L、引物 Galectin-l-F (25pmol/μ L)、Galectin_l-R (25pmol/μ L)及 lOmmol/L dNTPs各 0.5 μ L，加水 30 μ L，煮沸变性 1min,冰浴 5min，加 Taqplus DNA 聚合酶 0.25 μ L (5U/μ L)混匀，具体反应条件为94°C变性30sec，57°C退火40sec、72°C延伸90sec，25个循环后72°C再延伸lOmin，以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。
[0019]4、Galectin-Ι基因片段克隆与序列测定
将获得的PCR产物经胶回收纯化后直接克隆至PMD18-T载体质粒。转化大肠杆菌JM109。通过氨苄青霉素抗性筛选，获得重组质粒命名为pMD-Ga。经酶切和PCR初步鉴定后，阳性重组质粒送交大连宝生物工程公司进行序列测定。
[0020]Galectin-Ι基因核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0021](二)pIRESneo-Ga真核表达载体的构建 1、目的片段回收
称取Ig琼脂糖于10mL IXTAE中加热溶解；冷却至40-50°C时加入终浓度(V/V)为
0.1%的EB，混匀后倒胶；插入胶回收齿梳，室温冷却备用；将上样混合物(90 μ L PCR产物+10 μ L 1XLoading Buffer)加于上样孔中。以5V/cm的电压，电泳至所需时间后，取出凝胶，在透射紫外灯上观察，或拍照