高粱γ-氨基丁酸转氨酶基因SbGABA-Ts及其在逆境胁迫响应中的功能的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及高粱Y-氨基丁酸转氨酶（隶属于乙酰鸟 氨酸转氨酶（AAT_I)超家族成员之一）编码基因SbGABA-Ts，该基因与植物响应逆境胁迫 相关。本发明包含两个亚型基因的克隆、原核表达纯化、酶活鉴定、亚细胞定位及转录分析 等相关载体构建及分析方法。
【背景技术】
[0002] 随着生态环境的日益恶化，土壤干旱和盐碱化程度日渐严重，已经成为影响作物 高产、稳产的主要限制因子，因此提高作物的抗旱、耐盐碱性是目前亟待解决的重要课题之 一。应用现代生物技术，挖掘抗逆基因资源、培育耐逆品种，是提高作物产量和品质最为经 济、有效的方法，也是我国粮食生产可持续发展的重要举措。
[0003] 高粱（Sorghumbicolor(L. )Moench)是全球第五大禾谷类作物，是一种重要的 粮食、饲料、能源等多功能C4作物，光合作用效率高，生物产量大，同时高粱抗旱性强、耐 盐碱、产量高、适应性广，适合我国中低产田开发利用。高粱基因组相对较小（730Mb)， 遗传多样性丰富，被认为是禾本科类作物基因组结构、功能和进化研宄的重要模式基 因组之一（Calvin~〇M,MessingJ. (2011)Sweetsorghumasamodelsystemfor bioenergycrops.CurrentOpinioninBiotechnology, 23:1-7.)。随着高粱基因组测 序完成（PatersonAH,BowersJE,BruggmannR,etal. (2009)TheSorghumbicolor genomeandthediversificationofgrasses.Nature, 457:551-556；MaceES,TaiS H,GildingEK,etal. (2013)Whole-genomesequencingrevealsuntappedgenetic potentialinAfrica'sindigenouscerealcropsorghum.NatureCommunications ，4:2320|D0I:10. 1038/nco_s3320.)，覆盖高粱全基因组的高密度遗传连锁图谱构建也 日趋完善，基因功能鉴定以及遗传转化（KumarT,HoweA,SatoS，etal.(2013)Sorghum transformation:Overviewandutility.PlantGeneticsandGenomics:Cropsand Models，11:205-221.)的研宄亦取得了长足的进展。这对于高粱抗逆品种资源开发利用、抗 性机制的研宄、重要性状基因的克隆、分子标记辅助选择育种奠定了基础。
[0004] y-氨基丁酸（y-aminobutyricacid，GABA)是在生物体内广泛存在的一种四 碳非蛋白质氨基酸，其合成与代谢是通过TCA循环的一个旁路即GABA旁路进行的。已 有的研宄表明逆境胁迫下GABA代谢途径在植物体内碳氮源代谢、蛋白质降解调控、激素 合成、活性氧形成、多胺代谢、信号传递以及与其它代谢机制互作，增强植物抗逆性等方 面发挥重要的作用（ShelpBJ，BozzoGG，TrobacherCP，etal. (2012a)Strategies andtoolsforstudyingthemetabolismandfunctionofy-aminobutyratein plants.I.Pathwaystructure.Botany, 90:651-668；ShelpBJ,BozzoGG,ZareiA,et al. (2012b)Strategiesandtoolsforstudyingthemetabolismandfunction ofy-aminobutyrateinplants.II.Integratedanalysis.Botany, 90:781-793.)，但抗逆 分子机制目前还不清楚。在拟南芥和烟草等作物中研宄证实GABA积累和代谢在盐胁迫下 会被特异性地激活（RenaultH，RousselV，E1AmraniA，etal. (2010)TheArabidopsis pop2_lmutantrevealstheinvolvementofGABAtransaminaseinsaltstress tolerance.BMCPlantBiol. , 1:10-20；ZhangJ,ZhangY,DuY,etal. (2011)Dynamic metabonomicresponsesoftobacco(Nicotianatabacum)plantstosaltstress.J ProteomeRes.，10(4) : 1904-1914.)，其中y-氨基丁酸转氨酶（GABA-T)在盐胁迫中响应 起关键性的作用，表明GABA代谢途径与植物耐盐性密切相关。但从该途径研究高粱抗逆机 制目前还是个空白。
[0005] 由于GABA合成与代谢途径简单，遗传操作简便，在植物生长发育、信号转导、 抗逆性等方面发挥着重要的生物学作用（KonnoK，HirayamaC，YasuiH，etal. (2010) GABA,-alanineandglycineinthedigestivejuiceofprivet-specialist insects:convergentadaptivetraitsagainstplantiridoids.JChem Ecol.,36 (9):983-991；SuliemanS,SchulzeJ. (2010)Phloem-derivedy-aminobutyric acid(GABA)isinvolvedinupregulatingnoduleN2fixationefficiencyinthe modellegumeMedicagotruncatulapce.Plant,CellandEnvironment，33:2162-2172 ; FaitA，NesiAN,AngeloviciR，etal. (2011)Targetedenhancementofglutamate toy-aminobutyrateconversioninArabidopsisseedsaffectsC_Nbalance andstoragereservesinadevelopment-dependentmanner.PlantPhysiology Preview，157 (3) : 1026-1042.)，因此有关GABA代谢旁路的抗逆作用机制成为当前研究的 一个热点和难点。
[0006] 已有的研宄表明GABA的功能主要与植物对逆境的应激反应有关，逆境胁迫会 导致植物体内大量积累GABA(RenaultH,RousselV，ElAmraniA,etal. (2010)The Arabidopsispop2~lmutantrevealstheinvolvementofGABAtransaminasein saltstresstolerance.BMCPlantBiol.,1:10-20；RenaultH,AmraniAE，Palanivelu R，etal. (2011)GABAaccumulationcausescellelongationdefectsandadecrease inexpressionofgenesencodingsecretedandcellwall-relatedproteins inArabidopsisthaliana.PlantCellPhysiol.，52(5):894_908)d有关逆境胁迫 下植物中GABA能够快速大量积累的现象存在几种解释，其中一种解释是由于逆境胁 迫对gad基因表达、GAD酶活性、及GABA的合成产生影响，而GABA代谢和含量的变化 可能与植物体中的碳/氮源平衡有关（ZhangJ，ZhangY，DuY，etal.(2011)Dynamic metabonomicresponsesoftobacco(Nicotianatabacum)plantstosaltstress. JProteomeRes.，10(4) : 1904-1914.)。另外一种解释是GABA的产生可能与腐胺降解 途径有关（DittamiSM，GravotA，RenaultD，etal. (2011)Integrativeanalysisof metaboliteandtranscriptabundanceduringtheshort-termresponsetosaline andoxidativestressinthebrownalgaEctocarpussiliculosus.PlantCell Environ.，34(4) : 629-642.)，说明GABA的积累与可能多胺氧化降解有关，在植物抗逆生理 中发挥作用。
[0007] GABA在植物受到逆境胁迫时能够快速积累已经得到了很好的证实。然而，GABA及 其代谢途径在不同逆境胁迫响应中的作用和特异性目前尚不清楚。以拟南芥作为模式作 物，经过十几年的研宄，通过对GABA代谢途径酶学组成、功能及其作用域的解析，初步建立 了植物中GABA代谢途径的区室化模型（见图1)。GABA代谢途径包括位于质膜的GABA转 运体、线粒体GABA透性酶（GABP)、胞质Ca2+/钙调蛋白和pH调控的谷氨酸脱羧酶（GAD)、 具有丙酮酸和乙醛酸底物活性调控的线粒体GABA转氨酶（GABA-T)、以及位于线粒体调控 氧化还原反应的琥珀半醛脱氢酶（SSADH)，随着研宄的深入，又发现位于胞质和质体由氧化 还原反应调控的乙醛酸/琥珀酸半醛还原酶也分别参与GABA转运和代谢过程。研宄表明 GABA代谢途径在逆境胁迫中的生物学功能与其区室化的结构分布密切相关，但这个生化模 型并不能解释不同物种和组织间GABA代谢途径中同种类型酶之间的互补作用，及其转录 调控方面的差异（ShelpBJ，MullenRT，WallerJC. (2012)CompartmentationofGABA metabolismraisesintriguingquestions.TrendsPlantSci.，17 (2):57-59)〇
[0008] 近年来有关GABA代谢途径的相关基因的结构、表达及功能一直是研究的热 点之一。以往的研究大多是针对GABA合成途径中的基因结构、表达及功能进行的 解析（Bouche'N，FrommH. (2004)GABAinplants:justametabolite?Trends PlantSci.，9(3):110-116;AkamaK,TakaiwaF. (2007)C-terminalextensionof riceglutamatedecarboxylase(0sGAD2)functionsasanautoinhibitorydomain andoverexpr