针对柑橘全爪螨进行基因功能验证的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及昆虫的生长发育调控和基因工程领域，特别涉及一种针对柑橘全爪螨 进行基因功能验证的方法。
【背景技术】
[0002] 柑橘全爪螨是一种世界性害螨，对柑橘产量和品质影响较大，目前化学防治仍是 控制柑橘全爪螨的重要措施。化学农药施用不当，不仅影响果品安全，同时还会导致严重的 抗性药。基于RNA干扰技术获得抗昆虫的转基因材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得 成功。
[0003]RNA干扰（RNAinterference，RNAi)近年来发现的一种重要基因沉默现象，是指 在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是 通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特 定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。同时，在对昆虫、 叶螨等属于节肢动物门的农业害虫基因功能的研宄中，通过微量注射以及饲喂含有dsRNA 的人工饲料是目前用于导入dsRNA最主要的两种方法。然而，相比于一般昆虫个体更小的 柑橘全爪螨，如果想用微量注射的方法导入dsRNA难度较大，目前还没有对柑橘全爪螨导 入dsRNA方面的报道。为了满足方便地研宄柑橘全爪螨基因功能的需要，特别是为探索新 的柑橘全爪螨控制的有效方法，需要更好的柑橘全爪螨dsRNA导入的研宄。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于克服已有技术的缺陷，提供一种针对柑橘全爪螨 进行基因功能验证的方法。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一种针对柑橘全爪螨进行基因功能验证的方法，包括如下步骤：
[0007] 1)准备目的基因dsRNA溶液：根据要抑制的目的基因合成相应的dsRNA溶液；
[0008] 2)用柑橘叶片制作叶碟，用无核酸酶水清洗干净；
[0009]3)将清洗后的叶碟干燥处理至叶碟明显皱缩，用离心管盖盛装步骤1中制备好的dsRNA溶液，将叶碟漂浮于dsRNA溶液上，让叶碟吸收dsRNA溶液至恢复原状不再皱缩；
[0010] 4)将柑橘全爪螨置于步骤3中漂浮的叶碟上，将叶碟连同离心管盖放入培养箱， 用带透气孔的盖子盖住离心管盖，在22-28°C、湿度55-65%和光照：黑暗为14h:10h的条 件下培养60-80小时；
[0011] 5)培养结束后，收集柑橘全爪螨虫体提取RNA，检测步骤1中的目的基因的表达情 况。
[0012] 步骤1中所述目的基因为柑橘全爪螨COPB2基因，按照如下步骤制备该基因的 dsRNA溶液：
[0013] 1)提取柑橘全爪螨的总RNA，反转录为cDNA，再以该cDNA为模板，利用上下游 引物I7-C0PB2-S1 和I7-C0PB2-A1 进行PCR扩增；PCR条件为：98°C预变性 2min;98°C变 性158、60°0退火1〇8、72°0延伸3〇8，共34个循环；721：条件下延伸5111111丨0?反应体系 共25ul，包括：浓度为300-400ng/ul的cDNA模板0. 5ul，浓度为0. 15-0. 25uM的上下游引 物各lul，PrimeSTARMaxPremixl2. 5ul以及去核酸酶水 10ul;所述引物I7-C0PB2-S1 和 I7-C0PB2-A1的序列如下：
[0014]T7-COPB2-S1：
[0015] TAATACGACTCACTATAGGGCGTCGCTCATTTAGACAGAAC
[0016]T7-COPB2-A1：
[0017]TAATACGACTCACTATAGGGGGGATAATCATTGGCGTTGT。
[0018] 2)将步骤1中的PCR产物回收纯化之后作为合成dsRNA的转录模板，用体外合成 RNA试剂盒TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit按照使用说明转录合成并 纯化得到柑橘全爪螨C0PB2基因的dsRNA溶液；dsRNA合成反应体系为20ul，其中包括：PCR 胶回收产物 2. 5ul、5XTranscrptAidReactionBuffer4ul、浓度为lOOmM的ATP/CTP/GTP/ UTPMix8ul、TranscriptAidEnzymeMix2ul和DEPC-treatedwater3.5ul;反应条件 为：37°C孵育4h。
[0019] 步骤4中所述将柑橘全爪螨置于漂浮的叶碟上，每个直径l-2cm的叶碟上放20-30 头柑橘全爪螨。
[0020] 步骤5中所述检测目的基因的表达情况的方法为：收集柑橘全爪螨虫体提取RNA， 反转录得到相应的cDNA，然后以cDNA为模板利用qRT-PCR技术检测目的基因的相对表达量 验证抑制情况。
[0021] 本发明的有益效果是：本发明设计新颖、操作简单、基因沉默效率高，研宄应用成 本低，解决了柑橘全抓螨目前没有有效的dsRNA导入方法的问题，能够稳定而且有效地对 柑橘全爪螨进行RNA干扰，通过RNA干扰之后观察其表型，可以对柑橘全爪螨目标基因所预 测功能进行验证，探索研宄新的害虫控制方法。本发明适用范围广，只需要根据不同目标基 因设计特异性引物得到不同基因的dsRNA，均可以通过本发明方法将相应的dsRNA导入柑 橘全抓螨，该方法还可广泛应用于与柑橘全爪螨个体类似大小的其他叶螨。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明实施例中柑橘全爪螨置于漂浮的叶碟之上的示意图。
[0023] 图2是本发明实施例中C0PB2基因在RNAi之后的相对表达量结果图。
【具体实施方式】
[0024] 本发明实施例所用化学试剂来源如下：
[0025] RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN公司，德国）
[0026] PrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本）
[0027] 胶回收纯化试剂盒（Takara公司，日本）
[0028]TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit(ThermofisherScientific 公司，美国）
[0029] Perfect real time RT reagent (Takara公司，日本）
[0030] GoTaq?qPCR Master Mix(Promega公司，美国）
[0031] TranscriptAid Enzyme Mix (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0032] ATP/CTP/GTP/UTP Mix (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0033] PrimeScriptRT Enzyme Mix I(Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0034] Oligo dT Primer (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0035] Random 6mers (Thermo fisher Scientific公司，美国）
[0036] 针对柑橘全爪螨进行基因功能验证的方法，按照如下步骤操作：
[0037] 一、dsRNA的合成：
[0038] 1)根据转录组数据得到柑橘全爪螨C0PB2 ( 0subunitofcoatomerprotein complex)基因的cDNA序列（西南大学昆虫学与害虫控制重点实验室提供），设计含有17 启动子的C0PB2基因特异性引物，上下游引物序列分别为：
[0039]T7-C0PB2-S1 ：
[0040] TAATACGACTCACTATAGGGCGTCGCTCATTTAGACAGAAC
[0041]T7-C0PB2-A1 ：
[0042]TAATACGACTCACTATAGGGGGGATAATCATTGGCGTTGT。
[0043] 2)利用RNA提取试剂盒RNeasyPlusMicroKit按照使用说明提取柑橘全爪螨的 总RNA，然后利用反转录试剂盒PerfectrealtimeRTreagent按照使用说明将lug总RNA 反转录成为cDNA，反转录体系为20ul，其中包括：totalRNAlul(约lug)，5XPrimeScript Buffer4ul，PrimeScriptRTEnzymeMixIlul，OligodTPrimer(50uM)lul，Random 6mers(100uM)lul，RNaseFreedH20 12ul。反应条件为：37°C15min，85°C5s。再以该cDNA 为模板，利用引物I7-C0PB2-S1和I7-C0PB2-A1进行PCR扩增得到含有17启动子序列的 PCR产物。PCR条件为：98°C预变性2min;98°C变性15s、60°C退火10s、72°C延伸30s，共34 个循环；72°C条件下延伸5min。PCR反应体系共25ul，包括：cDNA模板0. 5ul(约200ng)， 上下游引物各lul(0? 2uM)，PrimeSTARMaxPremix12. 5ul以及去核酸酶水 10ul。
[0044] 3)将步骤2中的PCR产物用胶回收纯化试剂盒纯化回收之后作为合成dsRNA