食物中毒菌的培养基及食物中毒菌的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及培养食物中毒菌的技术，尤其涉及在同一培养基中同时培养多种食物 中毒菌的技术。
【背景技术】
[0002] 近年来，每年会发生超过千件的食物中毒事件。在发生食物中毒事件的情况下，为 了对成为原因的食物中毒菌进行确定，要进行增殖对象菌以判定其种类的操作。在增殖对 象菌时，基于保健站的技师的经验，对被推测为原因的对象菌全部进行单一培养。该单一培 养中，需要对每种对象菌考虑多种培养基及培养条件等。
[0003] 在这种现有方法中，存在食物中毒菌的培养及其检测需要花费大量的时间和成 本、劳力的问题。
[0004] 因此，以食物中毒菌的培养及检测中的省力化及迅速化、减少消耗品废弃为目的， 正在研究开发在同一培养基中同时培养多种食物中毒菌的技术。
[0005] 例如，根据专利文献1中记载的方法，能够同时培养金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、 大肠杆菌、弧菌、蜡状芽孢杆菌及李斯特菌这6种食物中毒菌。
[0006] 另外，在专利文献2中记载的方法中，记载了能够同时培养包含难以增殖的李斯 特菌在内的多种食物中毒菌。
[0007] 专利文献1 :日本特开2008-48670号公报
[0008] 专利文献2 :日本专利第4621919号公报
【发明内容】
[0009] 发明要解决的课题
[0010] 但是，专利文献1中使用的培养基存在难以稳定地培养对象菌的问题。特别是，在 含有倍增速率快的对象菌或杂菌等非对象菌的情况下，存在会因其影响而使一部分对象菌 的倍增速率变慢、无法适当增殖的问题。
[0011] 另外，专利文献2中使用的培养基存在无法充分增殖金黄色葡萄球菌、无法适当 地检测出金黄色葡萄球菌的问题。
[0012] 此外,专利文献1及2中，目的在于使对象菌增殖为103cfu/ml以上，因此，存在对 于用于迅速检验法等而言灵敏度不足、缺乏通用性的问题。
[0013] 于是，本发明人进行了深入研究，成功开发出了能够同时增殖在食品检验、流行病 学环境检验、环境检验及临床试验、家畜卫生中重要的4种食物中毒细菌即大肠杆菌、沙门 氏菌、金黄色葡萄球菌、及副溶血弧菌的培养基。
[0014] 此处，一般的迅速检验法（免疫层析法、ELISA法等）的检测下限为105cfu/ml，因 此，若考虑作为这些检验法的培养基进行利用的情况，则希望在实用的培养时间内将对象 菌增殖为10 5cfu/ml以上。另外，对于食物中毒菌来说，在生物化学试验中需要进行毒素产 生的评价，在过去的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌的食物中毒发生事 例中,对象菌以105cfu/ml以上存在时会产生毒素，引起食物中毒。因此，从这种观点出发， 也希望将对象菌增殖为105cfu/ml以上。
[0015] 此外，在同时检验多种食物中毒菌时，不同种类的食物中毒菌间的菌数之差很重 要。即，在使用了多重PCR等的迅速检验法中，若菌数之差高至10 3cfu/ml以上，则在同时 扩增多种食物中毒菌的情况下，相对较少的菌无法适当地扩增，难以检测。因此，希望按照 菌数之差小于10 3cfu/ml的方式使其增殖。
[0016] 本发明是鉴于上述情况进行的，其目的在于提供能够同时适当地增殖包含金黄色 葡萄球菌的多种食物中毒菌的食物中毒菌的培养基、以及食物中毒菌的检测方法。
[0017] 用于解决课题的方案
[0018] 为了达到上述目的，本发明的食物中毒菌的培养基的构成为：含有蛋白胨、酵母提 取物及硫酸镁。
[0019] 另外，本发明的食物中毒菌的检测方法为下述方法：利用含有蛋白胨、酵母提取物 及硫酸镁的培养基，使至少包含金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌同时增殖，由所增殖的 食物中毒菌提取DNA，将用于对食物中毒菌的DNA的扩增对象区域进行特异性扩增的引物 加入至PCR用溶液，通过PCR使扩增对象区域扩增，对所得到的扩增产物进行检测。
[0020] 发明的效果
[0021] 根据本发明，能够利用同一培养基同时适当地增殖包含金黄色葡萄球菌的多种食 物中毒菌。
【附图说明】
[0022] 图1是示出对本发明实施方式的合用了蛋白胨、酵母提取物及硫酸镁的培养基进 行了验证的试验1的结果的图。
[0023] 图2是示出对本发明实施方式的培养基的最佳蛋白胨浓度进行了验证的试验2的 结果的图。
[0024] 图3是示出对本发明实施方式的培养基的最佳氯化钠浓度进行了验证的试验3的 结果的图。
[0025] 图4是示出对本发明实施方式的培养基的最佳糖浓度进行了验证的试验4的结果 的图。
[0026] 图5是示出对本发明实施方式的培养基的最佳pH进行了验证的试验5的结果的 图。
[0027] 图6是示出对利用本发明实施方式的培养基和现有培养基的培养结束时的菌数 进行了验证的试验6的结果的图。
[0028] 图7是示出对在本发明实施方式的培养基中混入有杂菌时的培养基进行了验证 的试验7的结果的图。
[0029] 图8是示出对在本发明实施方式的培养基中添加了食品时的培养基进行了验证 的试验8的结果的图。
[0030] 图9是示出用于对各试验中使用的食物中毒菌的DNA中的扩增对象区域进行特异 性扩增的引物的碱基序列的图。
[0031] 图10是示出通过电泳检测利用试验1中培养的食物中毒菌的DNA进行多重PCR 所得到的特异性扩增产物的结果的图。
[0032] 图11是示出通过电泳检测利用试验3中培养的食物中毒菌的DNA进行多重PCR 所得到的特异性扩增产物的结果（氯化钠浓度〇~1. 5% )的图。
[0033] 图12是示出通过电泳检测利用试验3中培养的食物中毒菌的DNA进行多重PCR 所得到的特异性扩增产物的结果（氯化钠浓度2. 0~3. 5% )的图。
【具体实施方式】
[0034] 下面，对本发明实施方式的食物中毒菌的培养基及食物中毒菌的检测方法进行详 细说明。
[0035] 本发明实施方式的食物中毒菌的培养基的特征在于，其含有蛋白胨、酵母提取物 及硫酸镁。根据本实施方式的食物中毒菌的培养基，通过这种构成，可以同时增殖至少包含 金黄色葡萄球菌的多种食物中毒菌，尤其可以同时适当地增殖大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色 葡萄球菌及副溶血弧菌。
[0036] [检测对象菌]
[0037](大肠杆菌）
[0038] 大肠杆菌（Escherichia coli)是革兰氏阴性、兼性厌氧性的杆菌。其为肠内细 菌的一种，大多大肠杆菌是无害的，但是存在一部分会引起腹痛或腹泻等的大肠杆菌，这 些被称为致病性大肠杆菌。0157等有名的肠出血性大肠杆菌（EHEC、enterohemorrhagic Ε· coli)的生长pH(最佳pH)为4. 4~9. 0(6. 0~7. 6)、生长温度（最佳温度）为7. 0~ 46. 0 (35~40)。作为培养基，一般使用mEC培养基。
[0039] (沙门氏菌）
[0040] 沙门氏菌（Salmonella sp.)是革兰氏阴性、兼性厌氧性的杆菌，是肠内细菌的一 种，存在一部分会引起感染型食物中毒的沙门氏菌。沙门氏菌的生长pH(最佳pH)为3. 8~ 9. 5 (7. 0~7. 5)、生长温度（最佳温度）为5. 2~46. 2 (35~43)。作为培养基，一般使用 缓冲蛋白胨水溶液。
[0041] (金黄色葡萄球菌）
[0042] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是葡萄球菌的一种，为革兰氏阳性、兼 性厌氧性的球菌。常存在于人体的皮肤或鼻腔、肠内，对健康人类也会引起疾病，但如果菌 少的话，通常其毒性较弱。除了引起食物中毒外，还是表皮感染症、肺炎、脑膜炎等各种感 染症的病因菌。金黄色葡萄球菌的生长pH (最佳pH)为4. 2~9. 3 (7.0~7. 5)、生长温度 (最佳温度）为6. 5~46. 0 (30~37)。作为培养基，一般使用添加了食盐的胰蛋白胨大豆 肉汤培养基（tryptic soy broth medium) 〇
[0043] (副溶血弧菌）
[0044] 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)是革兰氏阴性、嗜盐性的杆菌。主要生 活在海水中，若人感染副溶血弧菌，则会发生食物中毒。副溶血弧菌的生长pH(最佳pH)为 5. 5~9. 6 (7. 6~8. 0)、生长温度（最佳温度）为10. 0~43. 0 (35~37)。作为培养基，一 般使用碱性蛋白胨水溶液。
[0045] 在这些食物中毒菌中，只有金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性,与革兰氏阴性菌相比， 革兰氏阳性菌的增殖速度慢，因此，以往非常难以利用同一培养基同时对它们进行培养。
[0046] 即，若利用同一培养基同时培养这些多种食物中毒菌，贝U大肠杆菌和沙门氏菌先 大量增殖，其结果，金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的生长受到抑制，尤其存在金黄色葡萄球 菌无法充分增殖的问题。另外，副溶血弧菌的生长需要氯化钠，但培养基中的氯化钠浓度对 其它菌的生长也有影响。
[0047] 因此，为了能够均衡地进行这4种菌种的增殖，本发明实施方式的食物中毒菌的 培养基在培养基的组成方面进行了钻研。
[0048]