一株耐乙醇运动发酵单胞菌及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一株耐己醇运动发酵单胞菌及其制备方法和 应用。 技术背景
[0002] 随着能源危机的不断高涨W及环境问题日益突出，利用再生资源制备生物燃料领 域越发受人瞩目，其重要性也不断凸显。在过去几十年中，生物己醇的生产一直受人关注。 其中，利用运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis)制备生物己醇的研究已进行多年。运动 发酵单胞菌作为唯--种通过化tner-Doudoroff巧D)代谢途径发酵葡萄糖的微生物，具 有较高的己醇发酵力和己醇耐受性等优势，在生物己醇生产中具有重要地位。
[0003] 然而，在纤维素等生物质己醇发酵过程中，许多环境压力因素抑制着菌体的生长 及其己醇发酵的能力。高己醇浓度、渗透压W及有氧胁迫等是抑制运动发酵单胞菌的生长 和己醇发酵的主要因素。如何获得高耐受性菌株，是研究者多年来的愿望。
[0004] 然而，在现有技术中，可耐己醇的运动发酵单胞菌少之又少，且耐受能力普遍较 低。其原因在于，一般的诱变育种方法所需时间长、效率低且随机性巨大。随着基因工程技 术的发展，利用基因工程技术改造细菌并获得耐己醇的运动发酵单胞菌可能成为解决该一 问题的方法。然而，在如何对运动发酵单胞菌进行基因改造使之耐受己醇方面上，目前的研 究还很少，且尚未获得确切认识。
[0005] 因此，亟待找到一种可W获得耐己醇运动发酵单胞菌的基因工程改造方法。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一株耐己醇运动发酵单胞菌， 该耐己醇运动发酵单胞菌含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的化oD蛋白的点突 变为Q5化、G426C和I448N ;所述耐己醇运动发酵单胞菌能耐受初始浓度至少为9%的己醇； 所述耐己醇运动发酵单胞菌的分类命名为皿?如7is ZM4-mropD，保藏于中国普 通微生物菌种保藏管理中也（北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所邮编100101)，保藏号为CGMCC NO. 10617,保藏时间为2015年3月12日。
[0007] 一般而言，Q57残基负责调控DNA连接和启动子连接，W获得正确的启动，因此，突 变Q5化有可能影响了 DNA和启动子对RNA聚合酶的连接。突变I448N的作用，有可能是W 一种未知而精妙的方式影响着转录。虽然该菌株耐己醇的机理还有待研究，但该菌株的耐 己醇性能是十分优良的。如本发明的一个实施例所示，本发明的菌株可W耐受初始浓度至 少为9%的己醇，在己醇初始浓度为10%时仍可W较为良好的生长。在含有己醇初始浓度为 9%的RM培养基中，本发明菌株ZM4-m巧oD在培养4她后，菌体浓度便达到了 0Dew=l. 5,而 对照菌株ZM4-巧oD (化oD未受突变）的菌体浓度仅为0〇6。。=0. 8。
[0008] 需要指出的是，本发明得到的菌株含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的 化oD蛋白的点突变为Q57L、G426C和I448N，任何在本发明的基础上，再对其它无关的位置 进行突变而得的菌株，均实质上与本发明相同，仍属本发明的保护范围。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供耐己醇运动发酵单胞菌的制备方法，该方法包括如 下步骤： 1) 突变巧oD 基因的制备；利用 GeneMo;rph II Random Mutagenesis Kit 对;rpoD 的 PCR产物进行易错聚合酶链式反应；筛选出编码蛋白的点突变在Q5化、G426C和I448N的突 变巧oD基因； 2) 重组质粒pBmrpoD的构建；将步骤1)所得物进行纯化后，用化;Ml I和思<3 I 处理，再连接到与质粒地BRlMCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒地皿poD，所述 pBBRlMCS-tet含有丙丽酸脱駿化酶的启动子和终止子； 3) 将重组质粒地皿poD转化入运动发酵单胞菌Z. mobilis ZM4中，并在培养基中进行 培养； 4) 将步骤3)的培养物接种到含有己醇的培养基中，己醇初始浓度为7-9%，经H轮筛选 后，将细菌置于含有9%己醇和5 y g/ml四环素的固体培养基上培养，随机挑选单克隆，提 取质粒后，进行DNA测序。
[0010] 所述纯化是利用E. Z. N. A?Gel Extraction Kit,并严格按照产品说明书操作说明 进行的。
[0011] 步骤3)和步骤4)中，所述培养基为RM培养基。
[0012] 步骤3中，所述转化为电转化。
[0013] 步骤3中，在所述培养时，培养方式为：先于RM固体培养基进行培养，再于RM液体 培养基中在3(TC下静置过夜培养。
[0014] 本发明的第H个目的在于提供所得的耐己醇运动发酵单胞菌在己醇生产上的应 用。如本发明的一个实施例所示，在含有己醇初始浓度为9%的培养基中培养2化之后，本 发明菌株ZM4-mE4消耗了近78%的葡萄糖，而对照菌株ZM4-巧oD仅仅消耗了 35%左右的葡 萄糖；培养5化之后，本发明菌株ZM4-m巧oD消耗了近93%的葡萄糖，而对照菌株ZM4-巧oD 仅消耗了 70%左右的葡萄糖。该证明本发明菌株ZM4-mE4在生产己醇时，能耐受较高浓度 的己醇，可W更高效的利用葡萄糖进行繁殖生长，实现己醇的高效生产。
[0015] 本发明的有益效果： 1、 本发明所得菌株具有优良的耐受己醇的能力，能耐受初始浓度至少为9%的己醇； 2、 本发明的制备方法工艺要求不苛刻，易于操作； 3、 本发明菌株ZM4-mrpoD在己醇生产上具有巨大的应用前景。
【附图说明】
[0016] 图1为不同己醇浓度对本发明菌株ZM4-m巧oD和对照菌株ZM4-巧oD生长的影响， 图中，ZM4-m巧oD为本发明菌株ZM4-m巧oD，ZM4-巧oD为对照菌株ZM4-巧oD，ethanol意为 己醇； 图2为本发明菌株ZM4-m巧oD和对照菌株ZM4-巧oD在不同己醇浓度下的生长曲线；a 为在己醇浓度为0%的生长曲线，b为在己醇浓度为6%的生长曲线，C为在己醇浓度为8%的 生长曲线，d为在己醇浓度为10%的生长曲线； 图3为本发明菌株ZM4-m巧oD和对照菌株ZM4-巧oD在己醇浓度为9%时对葡萄糖的消 耗情况，其中，Glucose concentration of ZM4-巧oD意为"培养对照菌株ZM4-巧oD后，培 养基所剩葡萄糖的浓度"，Glucose concentration of ZM4-nirpoD意为"培养本发明菌株 ZM4-m巧oD后，培养基所剩葡萄糖的浓度"，Growth of ZM4-巧oD意为"对照菌株ZM4-巧oD 的生长情况"，Growth of ZM4-nirpoD意为"本发明菌株ZM4-nirpoD的生长情况"，Glucose意 为"葡萄糖"，Cell growth意为"细菌生长"； 图4为在含有己醇情况下本发明菌株ZM4-m巧oD和对照菌株ZM4-巧oD的粗提物中的 丙丽酸脱駿酶（roc)和己醇脱氨酶（ADH)的活性表征图； 图5为本发明菌株ZM4-m巧oD和对照菌株ZM4-巧oD在不同己醇浓度下，a化B和pdc的 表达的倍数情况，A为在己醇浓度为0%的情况，B为己醇浓度为9%的情况； 图6为本发明菌株ZM4-nirpoD的重组质粒pBmrpoD和对照菌株ZM4-巧oD的重组质粒 pBmrpoD的示意图，Ppdc和化dc分别代表丙丽酸脱駿酶的启动子和终止子。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是W下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0018] 下述实施例中所需的引物序列如表1所示。
[001引 实施例1 重组质粒pBm巧oD的构建： 利用GeneMo;rph II Random Mutagenesis Kit对化oD的PCR产物进行易错聚合酶链 式反应；筛选出编码蛋白的点突变在Q57L、G426C和I448N的突变rpoD基因；将反应产物 利用E. Z. N. A?Gel Extraction Kit进行纯化后，用公a紐I和思a I处理，再连接到与质 粒地BRlMCS-tet所对应的限制性位点即得重组质粒地皿poD,所述地BRlMCS-tet含有丙丽 酸脱駿